本发明专利技术适用于生化技术领域，提供了一种高通量筛选乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)抑制剂的方法和盐酸安他唑啉及其衍生物作为HBV抑制剂的应用。本发明专利技术首次将盐酸安他唑啉应用于抗乙型肝炎病毒，对HBVDNA的半数抑制浓度(IC50)可达2.910μM，可作为新型HBV抑制剂治疗HBV所引起的感染。
Application of Antazoline Hydrochloride Derivatives as HBV Inhibitors
The invention is applicable to the field of biochemical technology, and provides a high throughput screening method for hepatitis B Virus (HBV) inhibitors and the application of antazoline hydrochloride and its derivatives as HBV inhibitors. The present invention applies antazoline hydrochloride to anti-hepatitis B virus for the first time, and the half inhibitory concentration (IC50) of HBV DNA can reach 2.910 ugM. It can be used as a new type of HBV inhibitor to treat infection caused by HBV.
【技术实现步骤摘要】
盐酸安他唑啉衍生物作为HBV抑制剂的应用
本专利技术属于生化
，尤其涉及高通量筛选HBV抑制剂的方法和盐酸安他唑啉及其衍生物作为HBV抑制剂的应用。技术背景乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科，主要感染人的肝细胞，可导致急性或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，严重威胁着人们的生命健康。HBV(HepatitisBvirus)完整粒子的直径为42nm，称为Dane颗粒，由外膜和核衣壳组成，有很强的感染性。我国是HBV中、高流行地区，慢性乙型肝炎是常见的多发病，给病人造成沉重的经济负担，给社会经济发展带来诸多问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。目前接种乙型肝炎疫苗是预防HBV感染的主要手段。95％以上的婴儿、儿童和青年接种全系列乙型肝炎疫苗后能有效预防HBV的感染。现今批准用于慢性乙型肝炎的抗病毒药物包括两类：IFN(普通INFα、聚乙二醇化INFα)和核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等)。这些药物的使用为慢性乙型肝炎抗病毒治疗提供了强有力的武器，可有效地控制HBV感染，延缓肝硬化进程，降低肝癌发病率，提高长期存活率。但现存的治疗手段并不能完全清除人体中的HBVcccDNA。然而，在研发新型疫苗时，通常需要经过很长周期的研究开发、临床验证等阶段，需要投入大量的研发经费、时间、人力和物力，即研究开发新型疫苗的周期长且开发成本高。由于已知药物对人体的副作用研究相对比较完善，所以“已知药物新用途”可以大大地缩短药物进入临床实验的时间，节省大量的毒副作用临床验证，因此，节约了大量的研发经费、人员等的投入。这已经成为未来医药领域的药物研发的新趋势。目前盐酸安他唑啉在临床上主要用于抗组胺，还没有任何现有技术报道其在抗HBV上的应用。本专利技术以乙型肝炎病毒(HBV)为研究对象，利用HepAD38细胞系建立筛选模型。其中，该模型是根据HepAD38细胞系的特点(即细胞基因组上插入HBV序列，序列上游有CMVtet启动子，可通过四环素或其类似物DOX启动HBV的复制)，通过商业化试剂盒中的核酸释放剂直接使样本中的核酸从其他物质结合的状态中释放出来，更直接高效地检测上清中HBVDNA的拷贝数，不用经过提取的过程，相比于根据Huh7细胞建立的转染和感染体系，培养时间大大缩短，且能在96孔板中实现化合物筛选实验。
技术实现思路
本专利技术公布了HepAD38高通量体外评价模型的建立。包括如下步骤：将加DOX处理一周及以上的HepAD38细胞按照每孔4×104～5×104个铺至96孔胶原板中，培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，撤去DOX。继续在培养箱在培养16～24h。用DMEM+10％血清+1％青链霉素+1％DMSO(二甲基亚砜)的培养基将储液形式的待测化合物稀释成10μM～100μM。将孔中的原培养基吸走，在96孔板的第2～7列中的B→J行孔中分别加入稀释好的化合物，每个化合物设置3个复孔，第11行6个孔设置3个阳性对照和3个细胞对照。置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养72h后，弃去上清换液。相同的稀释操作后继续置于培养箱中培养48h后，收上清待测。本专利技术旨在提供盐酸安他唑啉作为HBV抑制剂的新用途。本专利技术还提供了盐酸安他唑啉作为HBV抑制剂的应用方法，包括如下步骤：将HepAD38细胞按照4×105个/孔接种于12孔胶原板中，37℃，5％CO2孵育24h后，将储液浓度为10mM的盐酸安他唑啉用培养基稀释至30μM，并3倍浓度梯度依次稀释成10μM，3.33μM，1.11μM，0.370μM，0.123μM等5个浓度，每个浓度设置3个复孔加至2个12孔板中，并设置3个细胞对照组。37℃，5％CO2孵育72h后换液，继续孵育48h后收上清液。用ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测培养上清中的HBeAg、HBeAg和HBVDNA。提其胞内HBVcore-associatedDNA并进行Southernblot。本专利技术应用上述筛选方法对FDA已批准上市的成药化合物库中的近800个化合物进行筛选，选出对HBV的标志物(HBsAg、HBeAg和HBVDNA)有抑制作用的化合物。其筛选结果显示化合物Antazolinehydrochloride(盐酸安他唑啉)对HBVDNA有较好的抑制效果，其EC50为2.910μM左右，CC50为30μM以上。本专利技术还提供了部分盐酸安他唑啉衍生物在制备抗HBV药物中的应用，后续将用作新型HBV抑制剂。附图说明图1a～图1c是采用本专利技术建立的HepAD38高通量评价模型验证LAM对HBV的抑制作用的可行性实验结果；图2a～图2b是FDA库成药化合物对HBVDNA的抑制效果；图3a～图3e是盐酸安他唑啉对HBV的抑制效果。具体实施方式本专利技术将盐酸安他唑啉的生物活性测试过程为具体实施例，对本专利技术所涉及到的给药方式和盐酸安他唑啉衍生物的具体合成路线进行说明，但实施例的选择并不意味着本专利技术的制备方法的任何限制。已知LAM对HBVDNA有明显的抑制效果，而对HBeAg和HBsAg没有显著的作用，因此本专利技术以Lamivudine(拉米夫定，LAM)作为阳性参照验证HepAD38体外筛选模型的可行性。具体的验证操作过程如下：将LAM加至铺有HepAD38的96孔胶原板中，每孔的细胞数为4×104个，用含10％FBS+1％青链霉素+1％DMSO的DMEM培养基将LAM稀释至浓度为10μM的工作液，设置一组细胞对照。分别在加LAM的第0，2，4，6天收集上清液、更换同样浓度的LAM工作液。分别通过ELISA试剂盒和乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒检测细胞培养上清液中的HBeAg、HBsAg和HBVDNA含量并记录测试数据，并利用GraphPadPrism进行数据处理。实验验证结果详见图1a～图1c，从图1a～图1c所示结果来看，从加入LAM工作液的第4天开始，细胞培养上清液中的HBeAg、HBsAg和HBVDNA的量均有显著的变化。该实验结果表明上述的筛选模型可以用于筛选对HBV的标志物(HBsAg、HBeAg和HBVDNA)有抑制作用的化合物。本专利技术采用下述筛选方法对FDA成药化合物库中的近800个化合物进行初次筛选(该FDA化合物库从MCE公司购得，共计796种化合物，包括Anti-infectionLibrary(抗感染库)和GPCRG库)。具体的筛选流程如下：(1)HepAD38细胞的复苏：将冻于液氮中的HepAD38细胞在37℃水浴锅中快速解冻，加入至装有10ml培养基的培养皿中，培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，并加入10μl2mg/ml的DOX。置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。(2)HepAD38细胞的铺板和加药实验：将HepAD38细胞以每孔4×104个铺至96孔胶原板中，为防止边缘效应，只铺中间60个孔，边缘36个孔每个加入100μlPBS缓冲液。培养基含有DMEM+10％血清+1％青链霉素，撤去DOX。继续在培养箱在培养16～24h。已知FDA库中的化合物均为10mM储液，用DMEM+10％血清+1％青链霉素+1％DMSO(二甲基亚砜)的培养基将上述化合物配制成10μM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.本专利技术公开了一种高通量筛选HBV抑制剂的方法，所述方法可准确评价化合物对HBV的抑制效果，并可快速获得对HBV有抑制作用的前体化合物。该高通量筛选HBV抑制剂的方法，包括如下步骤：将HepAD38细胞按照每孔4×10
【技术特征摘要】
1.本发明公开了一种高通量筛选HBV抑制剂的方法，所述方法可准确评价化合物对HBV的抑制效果，并可快速获得对HBV有抑制作用的前体化合物。该高通量筛选HBV抑制剂的方法，包括如下步骤：将HepAD38细胞按照每孔4×104～5×104个铺至96孔胶原板中，在培养箱中培养16h～24h；将待测化合物用培养基稀释成10μM～100μM加至上述96孔板中，继续在培养箱中培养72h；弃去培养基，将待测化合物进行相同的稀释操作后换液，将96孔板继续置于培养箱中培养48h后，收上清待测。2.根据权利要求1所述的高通量筛选HBV抑制剂的方法，对FDA...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪颖，陈新文，吴春晨，胡雪，李敬，赵怡楠，袁一菲，刘粲誉，胡杨洋，赵凯涛，蔡岩，
申请(专利权)人：天津国际生物医药联合研究院，中国科学院武汉病毒研究所，南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。