一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法技术

一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，属于微生物发酵及食品加工领域，利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分，严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，利用自动生长曲线分析仪在600nm波长处测定12株菌在不同碳源条件下的光密度值，连续测定48小时，采用主成分分析法对测得的生长曲线进行分析，综合考虑3种碳源，鉴定方法科学，原理清晰，与现有的核糖体分型技术操作流程相比，本发明专利技术操作流程为菌株纯化‑同步‑生长曲线测定‑分析，操作简单，成本较低，建立了快捷可靠的株水平上的鼠李糖乳杆菌区分手段。

A New Identification Method of Lactobacillus rhamnosus

A new method for identification of Lactobacillus rhamnosus belongs to the field of microbial fermentation and food processing. 12 strains of Lactobacillus rhamnosus preserved in our laboratory are distinguished by using growth curve. The passage time of the strains is strictly limited. 12 strains of Lactobacillus rhamnosus are subcultured three times to make the growth state of the strains stable. 12 strains of Lactobacillus are determined at 600 nm wavelength by automatic growth curve analyzer. The optical density value under the sample is continuously measured for 48 hours. The growth curve measured is analyzed by principal component analysis. Three carbon sources are considered comprehensively. The identification method is scientific and the principle is clear. Compared with the existing ribosome typing technology, the operation process of the present invention is strain purification, synchronous growth curve determination, analysis, simple operation, low cost, and fast establishment. A reliable method for distinguishing Lactobacillus rhamnosus at strain level.

【技术实现步骤摘要】
一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法
本专利技术属于微生物发酵及食品加工领域，涉及一种益生菌发酵食品中的应用方法，特别是涉及一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法。
技术介绍
2001年，FAO/WHO联合将益生菌定义为“摄入足够数量后，对宿主健康提供益处的活的微生物”。被广泛应用的益生菌有乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌等。鼠李糖乳杆菌有较高的细胞黏附能力，可以增强免疫防御、缓解急性腹泻、降低血脂、预防龋齿和小儿湿疹、减少呼吸道感染以及改善克罗恩病症状等，是研究和应用最为广泛的乳杆菌。而益生菌赋予的健康益处和发酵性能具有菌株特异性，所以在株的水平上鉴定区分鼠李糖乳杆菌十分重要。现有的菌株区分手段包括核糖体分型、脉冲场凝胶电泳、多位点序列分型和随机扩增多态性DNA技术等基于DNA特征的分类方法，操作复杂，需要特殊设备，且耗时较长。生长能力是菌株基因特征和表达调控的具体表现，因而测定不同菌株在不同碳源中的生长能力，能够完成对菌株的区分。主成分分析作为一种常用的多元统计分析方法，可以实现对研究对象的简化与综合评价，还表示观测值和变量的相似性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有核糖体分型技术的大体操作流程为：菌株纯化-DNA提取-酶切-电泳-SouthernBlot-显示，操作极为繁琐、需要特定仪器和一定技术支持等不足，提出一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分。严格限定菌株传代时间(24小时)，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，利用自动生长曲线分析仪在600nm波长处测定12株菌在不同碳源条件下(葡萄糖、蔗糖和乳糖)的吸光度，连续测定48小时(间隔15分钟)，采用主成分分析法对测得的生长曲线进行分析，综合考虑3种碳源，可以有效区分不同的鼠李糖乳杆菌菌株。本专利技术的技术方案：一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法如下：(1)鼠李糖乳杆菌培养利用生长曲线对12株鼠李糖乳杆菌进行区分，无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在MRS固体培养基上划线纯化；(2)鼠李糖乳杆菌形态观察将纯化的菌落转接至MRS培养基，37℃培养24小时，收集1mL菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μL至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态；(3)鼠李糖乳杆菌生长曲线测定严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的MRS肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μL至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样，然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据，重复试验5次；(4)鼠李糖乳杆菌生长曲线比较选取所有测定的时间点及其对应的OD600nm值，利用SIMCA14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异，采用分类PCA的方法对各个菌株所有时间点的OD600nm值进行处理，将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12类，直观考察各组之间的相似和差异情况，样本与所选模型的相似度>0.05，记为“×”(相似度高，未区分)，相似度<0.05，记为“√”(相似度低，可区分)；(4-1)葡萄糖作碳源，PCA分类法的比较在葡萄糖作碳源时，PCA分类法的效果较差，151m和hsryfm1301相似度高，BG和F相似度高，Bm01和F、grx19、LV1、SP1相似度高，CRL1505和F相似度高，F和grx19、hsryfm1301、LV1相似度高，grx19和LV1、SP1相似度高，LV1和SP1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为5个类型；(4-2)乳糖作碳源，PCA分类法的比较在乳糖作碳源时，Bm01和F、LV1相似度高，F和grx10、grx19、LV1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为9个类型；(4-3)蔗糖作碳源，PCA分类法的比较在蔗糖作碳源时，只有151m和hsryfm1301相似度高，BG和grx10相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为10个类型；(5)鼠李糖乳杆菌菌株的区分葡萄糖是大多数乳酸菌的偏爱碳源，因而葡萄糖对菌株的区分能力不佳，乳糖和蔗糖的区分能力较好，综合三种碳源下，在试验进行的12株鼠李糖乳杆菌菌株中，均可利用生长曲线数据进行区分。本专利技术的有益效果为：本专利技术提出的一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，鉴定方法科学，原理清晰，利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分，严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，利用自动生长曲线分析仪在600nm波长处测定12株菌在不同碳源条件下的吸光度，连续测定48小时，采用主成分分析法对测得的生长曲线进行分析，综合考虑3种碳源，能够对12株菌进行有效区分。与现有的核糖体分型技术操作流程相比，本专利技术操作流程为菌株纯化-同步-生长曲线测定-分析，操作简单，成本较低，建立了快捷可靠的株水平上的鼠李糖乳杆菌区分手段。附图说明图1是本专利技术中不同鼠李糖乳杆菌在100×油镜下的镜检图片。图2是本专利技术中不同鼠李糖乳杆菌在葡萄糖MRS中的生长曲线。图3是本专利技术中不同鼠李糖乳杆菌在乳糖MRS中的生长曲线。图4是本专利技术中不同鼠李糖乳杆菌在蔗糖MRS中的生长曲线。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明：1.鼠李糖乳杆菌培养本专利技术利用生长曲线对本实验室保藏的12株鼠李糖乳杆菌进行区分。无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在MRS固体培养基上划线纯化。2.鼠李糖乳杆菌形态观察将纯化的菌落转接至MRS培养基，37℃培养24小时，收集1mL菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μL至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态。12株鼠李糖乳杆菌的镜检图均呈现典型的杆菌形态。菌株151m、BG、CRL1505、grx10、grx19、hsryfm1301、LYO和SP1的菌体形态相似，呈链状。菌株Bm01、F、LV1和LV108的菌体形态相似，呈短链(如图1所示)。3.鼠李糖乳杆菌生长曲线测定严格限定菌株传代时间(24小时)，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定。将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的MRS肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μL至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样。然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据。重复试验5次。生长曲线结果如图2、图3、图4所示。鼠李糖乳杆菌在蔗糖中生长差异明显大于葡萄糖，在乳糖中的生长差异居中。4.鼠李糖乳杆菌生长曲线比较选取所有测定的时间点及其对应的OD600nm值，利用SIMCA14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异。采用分类PCA的方法对各个菌株所有时间点的OD600nm值进行处理。将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12类。直观考察各组之间的相似和差异情况。样本与所选模型的相似度>0.05，记为“×”(相似度高，未区分)，相似度<0.05，记为“√”(相似度低，可区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法如下：(1)鼠李糖乳杆菌培养利用生长曲线对12株鼠李糖乳杆菌进行区分，无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在MRS固体培养基上划线纯化；(2)鼠李糖乳杆菌形态观察将纯化的菌落转接至MRS培养基，37℃培养24小时，收集1mL菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μL至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态；(3)鼠李糖乳杆菌生长曲线测定严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的MRS肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μL至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样，然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据，重复试验5次；(4)鼠李糖乳杆菌生长曲线比较选取所有测定的时间点及其对应的OD600nm值，利用SIMCA 14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异，采用分类PCA的方法对各个菌株所有时间点的OD600nm值进行处理，将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12类，直观考察各组之间的相似和差异情况，样本与所选模型的相似度>0.05，记为“×”，相似度<0.05，记为“√”；(4‑1)葡萄糖作碳源，PCA分类法的比较在葡萄糖作碳源时，PCA分类法的效果较差，151m和hsryfm1301相似度高，BG和F相似度高，Bm01和F、grx19、LV1、SP1相似度高，CRL1505和F相似度高，F和grx19、hsryfm1301、LV1相似度高，grx19和LV1、SP1相似度高，LV1和SP1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为5个类型；(4‑2)乳糖作碳源，PCA分类法的比较在乳糖作碳源时，Bm01和F、LV1相似度高，F和grx10、grx19、LV1相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为9个类型；(4‑3)蔗糖作碳源，PCA分类法的比较在蔗糖作碳源时，只有151m和hsryfm1301相似度高，BG和grx10相似度高，其它菌株均可区分，将12株菌分为10个类型；(5)鼠李糖乳杆菌菌株的区分葡萄糖是大多数乳酸菌的偏爱碳源，因而葡萄糖对菌株的区分能力不佳，乳糖和蔗糖的区分能力较好，综合三种碳源下，在试验进行的12株鼠李糖乳杆菌菌株中，均可利用生长曲线数据进行区分。...

【技术特征摘要】
1.一种新型鼠李糖乳杆菌鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法如下：(1)鼠李糖乳杆菌培养利用生长曲线对12株鼠李糖乳杆菌进行区分，无菌条件下，将12株菌的菌粉接种于MRS肉汤培养基，37℃培养24小时，将复苏的菌液在MRS固体培养基上划线纯化；(2)鼠李糖乳杆菌形态观察将纯化的菌落转接至MRS培养基，37℃培养24小时，收集1mL菌液，6000g离心5分钟，用纯净水重悬菌体；吸取10μL至载玻片，固定制片，染色，在光学显微镜100倍油镜下观察菌体形态；(3)鼠李糖乳杆菌生长曲线测定严格限定菌株传代时间，对12株菌进行3次传代，使菌株的生长状态稳定，将活化的菌液按3％的接种量接种到不同碳源的MRS肉汤培养基中，混匀后用移液枪精确吸取300μL至蜂窝培养板，每株菌做三个平行样，然后放入微生物自动生长曲线分析仪，参数设置为37℃培养48h，每隔15min读取一次数据，重复试验5次；(4)鼠李糖乳杆菌生长曲线比较选取所有测定的时间点及其对应的OD600nm值，利用SIMCA14.1软件进行分类主成分分析，考察不同菌株之间的生长情况的差异，采用分类PCA的方法对各个菌株所有时间点的OD600nm值进行处理，将每一株鼠李糖乳杆菌分为一类，共12...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾瑞霞，张玉律，张臣臣，黄玉军，陈霞，陈大卫，印伯星，管玉新，张兆俊，
申请(专利权)人：扬州大学，丹阳市康力乳制品有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32