新颖的启动子制造技术

本发明专利技术是关于(载体)疫苗领域，且尤其关于新颖的启动子序列、表达盒及载体，他们适于表达所关注的基因，尤其抗原编码序列。本发明专利技术的病毒载体可用于生产免疫原性组合物或疫苗。

A Novel Promoter

The invention relates to the field of vaccines, especially novel promoter sequences, expression boxes and vectors, which are suitable for expressing genes of interest, especially antigen coding sequences. The virus vector of the invention can be used to produce immunogenic compositions or vaccines.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖的启动子序列表本申请案根据37C.F.R.1.821-1.825含有序列表。本申请案随附的序列表以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术关于(载体)疫苗领域，且尤其关于新颖的启动子序列、表达盒及载体，他们适于表达所关注的基因，尤其抗原编码序列。本专利技术的病毒载体可用于生产免疫原性组合物或疫苗。
技术介绍
马病原体马α疱疹病毒1(马流产病毒，EHV-1)属于疱疹病毒目(Herpesvirales)疱疹病毒科(Herpesviridae)中α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的水痘病毒属(Varicellovirus)。其为具有约150,000个碱基对的双链DNA基因组的大包膜病毒。水痘病毒亚属的其他重要成员为人类α疱疹病毒3(水痘带状疱疹病毒)、猪α疱疹病毒1(伪狂犬病病毒)、牛α疱疹病毒1(感染性支气管炎病毒)及马α疱疹病毒4(马鼻肺炎病毒，EHV-4)(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.aspVirusTaxonomy:2015ReleaseEC47,London,UK,2015年7月；Emailratification2016(MSL#30)EHV-1及EHV-4为地方病且侵袭全世界的马。虽然EHV-4引起大多轻度的上呼吸道感染，但EHV-1可引起伴有自呼吸系统症状至流产及致死性脑脊髓病的一系列疾病的全身性感染，这视病毒株及宿主的免疫状态而定。目前，在美国及欧洲分别可使用两种经许可的针对EHV-1的改良式活毒疫苗(MLV)TM(BoehringerIngelheim)及TM(MSD)。两者均含有传统减毒的EHV-1RacH病毒株，其在猪上皮细胞中传代256次以便减毒(Ma等人2013)。减毒机制已在分子水平上加以研究。Osterrieder等人(1996)展示RacH不具有orf67的两个基因组拷贝且一个拷贝的恢复足以恢复毒力。另外，RacH携带1283bp缺失，移除大于90％的编码免疫抑制性病毒蛋白的orf1编码序列。其他突变亦可影响减毒，但迄今为止尚未详细研究。所有这一切使得RacH成为非常安全的疫苗株，因为(若可能)通过在经疫苗接种的动物体内传代回复毒力几乎不可能。含有马α疱疹病毒1(EHV-1)疫苗株RacH(pRacH-SE)的整个基因组的大肠杆菌细菌人工染色体(BAC)称为用于载体疫苗开发的平台。已展示基于EHV-1RacH的载体疫苗能够在包括猪、牛及犬的数个哺乳动物物种中引发免疫(Rosas等人2007，Rosas等人2008，Trapp等人2005，Said等人2013)。编码病原体的抗原蛋白的基因可由重组EHV-1RacH表达。EHV-1-RacH基因组是以其BAC形式在大肠杆菌中进行操纵且经调整以通常通过插入转基因表达盒表达额外蛋白质(Tischer等人,2010)。在pRacH-SEDNA转染于培养的容许细胞后，通过细胞转录因子开始EHV-1复制。病毒DNA聚合酶的活性使得所有BAC载体相关序列缺失及EHV-1RacH基因组恢复至其原始状态。生成无法与RacH区分的感染性病毒。当在大肠杆菌中例如通过插入转基因表达盒操纵pRacH-SE时，在容许细胞中转染后重建的病毒将携带修饰且将表达额外基因。重组EHV-1RacH可用作载体疫苗。然而，在无额外的外源启动子的情况下表达的转基因蛋白质的量通常相对较低。因此，对可用于自此类载体、尤其重组EHV-1RacH表达转基因蛋白质的额外启动子的需要尚未满足。野生型EHV-1病毒株在其基因组的特有长区段(序列坐标1298-3614；图2)的一端具有称为orf1、orf2及orf3的三个开放阅读框架(orf)。Orf1及orf3串联排列于DNA的一链上，而orf2由互补链编码。疫苗株RacH在影响orf1及orf2的区域具有1283bp缺失，表明这些基因对于病毒复制而言为非必需的。因此，该位点充当转基因插入位点。已报导，使用人类细胞巨大病毒立即早期基因1启动子-增强子(Boshart等人1985)自orf1/3插入位点有效表达转基因。在此类研究中，牛生长激素聚腺苷酸化信号(BGH)用于稳定转录物以便优选表达(Ma等人2012；Said等人2013)。虽然不存在HCMV可诱发人类肿瘤的迹象，但无法排除理论风险。在描述HCMV-IE增强子(Boshart等人1985)之前，在如猿猴病毒40、多瘤病毒或莫罗尼鼠肉瘤病毒(Moloneymurinesarcomavirus)的已知致癌病毒的基因组中发现大部分强劲的增强子。虽然极其强劲的非组织特异性HCMV及MCMV(小鼠细胞巨大病毒)IE启动子-增强子非常适于多种研究活动，但其一般可能不代表转基因载体疫苗的启动子的第一选择。具体而言，给动物接种疫苗的人员意外暴露的风险可被监管当局视为授予疫苗许可证的障碍。
技术实现思路
为了避免任何此类障碍，本专利技术提供新颖的用于转基因表达的调控核酸序列/启动子序列，尤其在载体疫苗的情形内及尤其在EHV-1载体的情形内。因此，上述技术问题的解决方案通过本说明书及在申请专利范围中表征的实施例来达成，且本专利技术在其不同方面中是根据申请专利范围来实施。本专利技术提供新颖的用于转基因表达的调控核酸序列/启动子序列、克服本领域的缺陷的免疫原性组合物、疫苗及相关方法。确定的广泛用于在包括疱疹病毒的不同载体系统中驱动高水平的转基因表达的启动子序列为HCMV(Boshart等人1985；Foecking及Hofstetter1986)或小鼠细胞巨大病毒(MCMV；等人1985)的立即早期基因的启动子序列或如猿猴病毒40(SV40)的致癌病毒的强启动子，例如SV40大T抗原启动子及更多(例如Kim等人1990)。此类强启动子为细胞生物学家偏好的，因为其自主地在不同细胞培养系统中起作用。在病毒复制的情形下，经感染细胞通过病毒功能转化成病毒复制机器。疱疹病毒复制及形态发生的生物学被充分理解。在感染后，仅极少基因(α-基因)经转录且翻译成立即早期蛋白质(IEp)。这些IEp为编码病毒酶(如DNA聚合酶及许多其他酶)的β-基因的转录活化因子。病毒基因组复制的起始标志着转录编码病毒结构蛋白的β-及γ-基因的病毒复制后期的开始(Fields,2013)。然而，对于改良式载体疫苗，上述自主性强启动子中无一者被视为选项，特别是来源于致癌病毒的启动子具有不利的安全概况。因此，需要提供在病毒复制的情形下具有高活性的启动子，如EHV-1β-及γ-基因的那些启动子。由于不可能在一个载体分子中使用一致的DNA序列两次而无进行内部同源重组且因此基因不稳定的风险，故本专利技术提供新颖的来源于EHV-4的公开基因组序列(马α疱疹病毒4病毒株NS80567，完整基因组，登陆编号AF030027，版本AF030027.1GI:2605950，日期1998年5月21日)的替代性启动子序列。该等基因与EHV-1基因的序列相同性在55至84％范围内。本专利技术提供两种新颖的启动子：p430及p455，其在细胞培养物中以及在动物(猪及小鼠)体内rEHV1-RacH复制的背景下展示具有功能性。两种新颖的启动子在病毒复制周期期间的活性水平似乎与自活体外启动子动力学实验所推断的极其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种启动子序列，其包含4pgG600(SEQ ID NO.1)或4pMCP600(SEQ ID NO.2)或其互补核苷酸序列，或其功能片段或其互补核苷酸序列，其中所述启动子序列引起所关注核苷酸序列、优选所关注基因、更优选抗原编码序列的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.20 EP 16189780.61.一种启动子序列，其包含4pgG600(SEQIDNO.1)或4pMCP600(SEQIDNO.2)或其互补核苷酸序列，或其功能片段或其互补核苷酸序列，其中所述启动子序列引起所关注核苷酸序列、优选所关注基因、更优选抗原编码序列的表达。2.一种表达盒，其包含选自由以下组成的群的启动子序列：4pgG600(SEQIDNO.1)及4pMCP600(SEQIDNO.2)及其互补核苷酸序列，及其功能及互补核苷酸序列，其中所述启动子序列可操作地连接于所关注序列；优选所关注基因，诸如抗原编码序列；更优选所关注异源和/或外源序列、所关注基因或所关注抗原编码序列，其中所述启动子序列引起所关注核苷酸序列、优选所关注基因、更优选抗原编码序列的表达，由此所述启动子序列优选为异源启动子序列、更优选外源启动子序列。3.一种载体，诸如病毒载体，其包含如权利要求2的表达盒。4.如权利要求1的启动子序列和/或如权利要求2的表达盒和/或如权利要求3的载体，其中所述的启动子序列的功能片段具有70％、80％、85％，优选90％、91％、92％、93％、94％，更优选95％、96％、97％、98％、99％、99.9％的序列相同性和/或同源性。5.如权利要求1或4的启动子序列和/或如权利要求2或4的表达盒和/或如权利要求3或4的载体，其中所述的启动子序列的功能片段长度为550个核苷酸，优选500、490、480、470、460、455、450、445、440、435、434、433、432、431、430个核苷酸，最优选455或430个核苷酸，或其中该启动子序列的该功能片段长度介于430至550个核苷酸、430至500个核苷酸或430至480个核苷酸之间。6.如权利要求1或4或5的启动子序列和/或如权利要求2或4或5的表达盒和/或如权利要求3至5的载体，其中所述的启动子序列的功能片段为截短的4pgG600(SEQIDNO.1)或其互补核苷酸序列，相对于整个长度的序列相同性优选为(至少)72％(或更高)。7.如权利要求1或4至6的启动子序列和/或如权利要求2或4至6的表达盒和/或如权利要求3至6的载体，其中所述的4pgG600(SEQIDNO.1)的功能片段为命名为p430(SEQIDNO.3)的片段。8.如权利要求1或4至7的启动子序列和/或如权利要求2或4至7的表达盒和/或如权利要求3至7的载体，其中所述的启动子序列的功能片段为截短的4pMCP600(SEQIDNO.2)或其互补核苷酸序列，相对于整个长度的序列相同性优选为(至少)78％(或更高)。9.如权利要求1或4至8的启动子序列和/或如权利要求2或4至8的表达盒和/或如权利要求3至8的载体，其中所述的4pMCP600(SEQIDNO.2)的功能片段为命名为p455(SEQIDNO:4)的片段。10.如权利要求2和4至9的表达盒和/或如权利要求3至9的载体，其中所述的载体包含一或多个其他调控序列，诸如终止信号、聚腺苷酸化信号或调控组件如IRES和/或2a肽。11.如权利要求3至10的载体，其中所述的载体为重组、和/或异源和/或外源载体。12.如权利要求3至11的载体，其中所述的载体为病毒载体，优选选自由以下组成的群：疱疹病毒科(herpesviridae)，诸如马α疱疹病毒1(EHV-1)、马α疱疹病毒4(EHV-4)及其他水痘病毒属(Varicelloviruses)，如PrV(伪狂犬病病毒)及BHV-1(牛疱疹病毒1)；腺病毒科(Adenoviridae，AdV)，诸如CAdV(犬腺病毒)；腺相关病毒科；杆状病毒科(Baculoviridae)；慢病毒科(Lentiviridae)，诸如反转录病毒；及痘病毒科(Poxviridae)。13.如权利要求3至12的载体，其中所述的病毒载体为疱疹病毒科、优选α疱疹病毒属、更优选水痘病毒亚属的成员，该载体最优选为马α疱疹病毒1(EHV-1)。14.一种制备载体、优选病毒载体的方法，其包含：a.提供如权利要求1或4至9中的启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·蒙特，A·加列，R·库昆特拉，R·B·曼德尔，K·雷米特，E·M·沃恩，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE