一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统技术方案

本发明专利技术公开了一种双基因靶向治疗系统rdHSV1‑IFNγ‑siRNA的构建方法，具体方法为：删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，突变VP16基因，得到复制缺陷型载体rdHSV1；对LAT基因靶序列进行筛选、靶位证实，做出siRNA核苷酸序列，其序列由序列表中的SEQ ID NO:2所示；将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒，与复制缺陷型载体rdHSV1进行同源重组，获得双基因靶向治疗系统rdHSV1‑IFNγ‑siRNA；本发明专利技术针对HSK目前亟待解决的病毒潜伏感染和复发问题，利用目前最先进的HSV病毒载体作为工具，建立了一种针对HSV病毒潜伏标志基因LAT基因和活化病毒的双基因靶向疗法，特异性定位到病毒潜伏部位进行基因沉默和干预治疗。

A dual gene targeting therapy system for recurrent HSK

The invention discloses a construction method of double gene targeting therapy system rdHSV1 IFN gamma siRNA, the specific method is: ICP4, ICP34.5 and ICP27 to remove the herpes simplex virus HSV1 gene, VP16 gene mutation by replication defective vector rdHSV1; the LAT gene target sequence were screened and confirmed the target, make siRNA the nucleotide sequence, the sequence shown by sequence in SEQ ID NO:2; IFN gene sequences and siRNA sequences were inserted into shuttle plasmid for homologous recombination and replication defective vector rdHSV1, double gene targeting therapy system rdHSV1 IFN gamma siRNA; the invention is based on HSK to be solved at present the latent virus infection and recurrence, as a tool using the most advanced HSV virus vector, a marker gene for the HSV virus latent virus LAT gene and activation of the double gene targeting therapy Method, specific localization to the latent part of the virus to carry on gene silencing and intervention treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统
本专利技术属于生物
，具体涉及一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统。
技术介绍
单纯疱疹病毒性角膜炎(HerpesSimplexKeratitis,HSK)是最常见的病毒性角膜炎，在角膜病中发病率和致盲率均居首位。该病由于单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirus,HSV)潜伏感染于人三叉神经节及角膜组织，容易复发，重症病例迁延不愈，最终失明。单纯疱疹病毒(HSV)对人的感染性很强。20岁以上的成年人中，血清抗体阳性率达90％，原发感染仅见于对本病毒无免疫力的儿童，多为6个月至5岁的小儿。原发感染后病毒终生潜伏于体内待机再发。继发感染多见于5岁以上儿童和成人。一些非特异性刺激如感冒、发热、疟疾、感情刺激、月经、日晒、应用糖皮质激素、退翳及创伤等都可能成为复发的诱因。目前该病发病机制不明，传统药物治疗副作用大，机体易产生耐药，手术治疗也难以解决复发，使其成为眼科世界性难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种治疗复发性HSK的双基因靶向治疗系统，以解决单纯疱疹病毒性角膜炎易复发、难治愈的问题。本专利技术采用以下技术方案：一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，至少包含复制缺陷型载体rdHSV1、来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列、siRNA核苷酸序列。进一步地，复制缺陷型载体rdHSV1通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。进一步地，IFNγ基因序列由序列表中的SEQIDNO:1所示。进一步地，siRNA核苷酸序列由序列表中的SEQIDNO:2所示。还包括一种复制缺陷型载体rdHSV1，通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。还包括一种来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列，其序列由序列表中的SEQIDNO:1所示：SEQIDNO：1GCTTATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCAAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAACTCGAGTCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCGTGGCAGGATGCTTTCGGGGATCGGTGGTCAGGCAGCCCGGGCCGCGGCTCTGTGGTTAACACCAGAGCCTGCCCAACATGGCACCCCACTCCCACGCACCCCACTCCCACGAACCCCACTCCACGCACCCCACTCCAAGCACCCCACTTCCAGCACCCACTCCAGACCCACTCCAGAACCCCACTCCAAGACCCCAATTCCAAGATCCCGGAACATTCAACACAGACAGGGAAAAAATCT。还包括一种siRNA核苷酸序列，其序列有序列表中的SEQIDNO:2所示：SEQIDNO:2TACGACAGCACATCCTCAGATAGTT。还包括将双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎的用途。还包括一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA的构建方法，具体方法为：删除单纯疱疹病毒HSV1中ICP4、ICP34.5和ICP27基因，突变VP16基因，得到复制缺陷型载体rdHSV1；对LAT基因靶序列进行筛选、靶位证实，做出一条siRNA核苷酸序列，其序列由序列表中的SEQIDNO:2所示；分离人血液淋巴细胞，接种HSV1病毒诱导入IFNγ基因，提取淋巴细胞总RNA，反转cDNA，获取IFNγ基因序列，其序列由序列表中的SEQIDNO:1所示；将IFNγ基因序列与siRNA序列分别连入穿梭质粒，与复制缺陷型载体rdHSV1进行同源重组，获得双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA。本专利技术的有益效果是：本专利技术针对HSK目前亟待解决的病毒潜伏感染和复发问题，首次将研究深入到基因水平，利用目前最先进的HSV病毒载体作为工具，建立了一种针对HSV病毒潜伏标志基因LAT基因和活化病毒的双基因靶向疗法，特异性定位到病毒潜伏部位进行基因沉默和干预治疗。这将为有效抑制病毒潜伏感染、解决HSK复发瓶颈提供新思路、新方法，为进一步临床防控HSK奠定基础，也将具有重要的理论创新意义和良好的临床应用前景。本专利技术通过改造单纯疱疹病毒HSV，制备出HSV1复制缺陷型病毒载体并使其携带抗病毒活性的干扰素γ基因(IFNγ)及促使LAT基因沉默的siRNA，建立一种双基因靶向治疗系统(rdHSV1-IFNγ-siRNA)，利用HSV1病毒嗜神经的特点，病毒载体可将双基因药物沿神经通路靶向地从眼角膜输送到病毒潜伏部位三叉神经节，达到精准、高效的治疗效果，彻底解决单纯疱疹病毒性角膜炎潜伏感染、反复发作的难题。【附图说明】图1为本专利技术中复制缺陷型载体rdHSV1的骨架结构示意图；图2为IFNγ基因序列与siRNA序列连入的穿梭质粒的同源重组过程图；图3为rdHSV1的载体骨架与穿梭质粒重组构建的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA过程及结构示意图；图4为Westernblot鉴定IFNγ结果图；图5为免疫组化检测三叉神经节中IFNγ水平图；图6为免疫组检测结果表达图；图7为siRNA对LATmRNA的沉默干扰作用的鉴定效果图；图8为Westernblot检测LAT蛋白的表达图。【具体实施方式】下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术公开了一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，如图2、图3所示，该双基因靶向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双基因靶向治疗系统rdHSV1‑IFNγ‑siRNA，其特征在于，至少包含复制缺陷型载体rdHSV1、来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列、siRNA核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，至少包含复制缺陷型载体rdHSV1、来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列、siRNA核苷酸序列。2.如权利要求1所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述复制缺陷型载体rdHSV1通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。3.如权利要求1或2所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述IFNγ基因序列由序列表中的SEQIDNO:1所示。4.如权利要求3所述的双基因靶向治疗系统rdHSV1-IFNγ-siRNA，其特征在于，所述siRNA核苷酸序列由序列表中的SEQIDNO:2所示。5.一种复制缺陷型载体rdHSV1，其特征在于，通过将单纯疱疹病毒HSV1中的ICP4、ICP34.5和ICP27基因删除，突变VP16基因而得到。6.一种来自于人血液淋巴细胞的IFNγ基因序列，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐琨，刘先宁，朱秀萍，程燕，郑璇，
申请(专利权)人：陕西省眼科研究所，
类型：发明
国别省市：陕西,61