一种肿瘤靶向双基因－病毒的构建方法，其特征在于包括下列步骤： （１）将两个肿瘤治疗基因克隆进质粒的多克隆位点，两基因之间以连接物连接；然后用Ｂｇｌ Ⅱ酶切出包含肿瘤特异性启动子、抗癌基因以及ｐｏｌｙＡ加尾信号的双基因表达框，插入肿瘤特异性病毒载体中； （２）将改造好的携带肿瘤靶向双基因的病毒载体转染细胞以产生双基因－病毒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种。
技术介绍
基因治疗是近十多年兴起的一种生物高技术方案，在整个基因治疗方案中，肿瘤基因治疗方案占60％以上，基因治疗曾被认为是人类最终征服肿瘤的希望。目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等。病毒载体转染率高，表达时间长，但免疫原性强，有一定危险性。非病毒载体包括裸露DNA、脂质体和其它物质包裹的DNA。非病毒载体则免疫原性小及安全性好，但转染率低，基因稳定性低，表达时间短。目前使用最多还是病毒载体。病毒载体又有两类一类可以整合到染色体如逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒。另一类则不能整合到染色体，如腺病毒、单纯疱疹病毒及EB病毒。在病毒载体中使用最多的还是腺病毒(Adv)载体，Adv有A、B、C、D、E、F等6大类，49个血清型，其中C类血清型2和5用得最多，腺病毒基因组全长36Kb，分早期基因(E)和晚期基因(L)，如果将早期基因E1区(约4Kb)缺失掉(有时还加上E3区3.6Kb的部分缺失)，则成为第一代基因治疗载体，这是常用的载体。第二代Adv除E1区等缺失外，还有E4、E2A区缺失以降低其免疫原性，但现在很少有人用。第三代无肠腺病毒Gutless Adv(简称为GL-Adv)载体则是将Adv的所有基因全部去除，仅保留两端的反向末端重复顺序(ITR)及装配基因，它没有抗原性，不会被抗体清除掉，故有长期疗效。腺相关病毒(AAV)是一种免疫原性极小的单链DNA病毒，它可以定点插入到染色体上，在目前使用中未发现任何毒付作用和致癌性。逆转录病毒(RTV)、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒也是较为常用的病毒载体。基因治疗的载体是将基因送到目的处，以发挥治疗(如抗癌)作用。基因治疗载体是关键，另一要素是基因，有关肿瘤治疗基因可以是抑癌基因、细胞因子基因等。临床上肿瘤的基因治疗方案有几百种，但没有重大进展，而肿瘤的病毒治疗却取得重大突破。美国ONXY医药公司研制出的突变腺病毒(ONYX-015，也叫dl1520)，乃将腺病毒基因组的E1b55K蛋白基因缺失，使得该突变的腺病毒能在p53缺失的肿瘤细胞内进行大量复制，而在正常细胞内不能复制。应用ONYX-015，联合常规的化学疗法治疗头颈癌患者，总有效率达63％(Nature Medicine，6879，2000)。但单独使用ONYX-015(不与化疗结合)，疗效只有15-20％。为了克服单独使用ONYX-015疗效不理想的缺点，刘新垣院士于2000年就提出了肿瘤的基因-病毒治疗策略肿瘤的基因治疗与病毒治疗相结合的策略(中国肿瘤生物治疗杂志，8(1)1，2001)。即我们首先构建E1B55KDa基因缺失的腺病毒载体ZD55，它与ONYX-015相似，只将基因靶向导入p53缺失的肿瘤细胞，而不进入正常组织细胞，但ZD55含有克隆位点，可以插入外源基因，故比ONYX-015好，我们将不同抗癌杀伤基因装入ZD55载体中构成ZD55-gene，用它进行治疗称之为基因-病毒治疗(Gene-ViroTherapy)。基因-病毒治疗策略已经获得了很好效果，相关内容已经申请了专利。应用此基因-病毒策略时，只用一个基因，但后来发现一个基因还不足以全部消灭肿瘤。为了强化基因-病毒治疗策略，刘院士又创建了双基因-病毒治疗(Dual Gene-ViroTherapy)策略，简单地说此策略是用两个抗癌基因把病毒载体武装起来以杀伤肿瘤，这样就可完全将小鼠身上建立的肿瘤全部消灭光，两个基因从两个不同角度抗肿瘤，则足以全部消灭癌块。这个策略的特点之一是使用两个基因装在肿瘤靶向载体之中，以全部杀灭肿瘤，即使用的是两个基因而不是一个或三个基因，所用的载体具有肿瘤的靶向性，只杀伤肿瘤组织细胞而不杀伤正常组织细胞。因为一个基因不足以全部杀死癌细胞，但三个或更多基因既是不需要的，也是不现实的，所以两个基因的靶向治疗是最佳选择。这个策略的特点之二是它有普遍意义，我们可以将构建的肿瘤靶向双基因装到其他载体中去，如AAV、GL-Adv等等，所以它有普遍意义。本专利只包括两个基因的靶向双基因-病毒治疗载体(Targeting Dual Gene-ViroTherapy)，不包括一个基因或三个以上的基因-病毒治疗载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就在于将肿瘤的基因治疗与病毒治疗二者的优势结合起来，从而提供一类具有肿瘤靶向，同时又能有效表达两个抗癌基因的重组病毒。为达到上述目的，本专利技术提供了一种抗癌靶向双基因-病毒的构建方法，其步骤包括(1)将两个肿瘤治疗基因克隆进质粒的多克隆位点，两基因之间可用IRES等连接物连接；然后用限制性内切酶切出双基因表达框(它包含CMV启动子、抗癌基因、SV40 poly A尾巴)，插入改造好的肿瘤特异性增殖病毒载体中；(2)将改造好的携带肿瘤靶向双基因的病毒载体转染细胞以产生双基因-病毒。本专利技术的构建双基因-病毒的方法，可以用于开发有效治疗肿瘤的抗癌新药，也可以与其它化合物组成药物组合物，所述化合物可以是化学治疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物，单克隆抗体等。本专利技术的有益效果1、本专利技术提供携带两种抗癌基因的重组病毒，经细胞实验证明，抗癌基因可以特异性地在肿瘤细胞中表达，而不在正常细胞中表达。经动物试验证明，可以用于治疗多种肿瘤；2、本专利技术提供了携带两种抗癌基因的病毒构建方法，该方法易于掌握； 3、本专利技术构建的病毒载体，能够非常方便的装入两种外源抗癌基因；使用这个载体能够构建多种携带抗癌基因的双基因-病毒，为肿瘤的基因-病毒治疗提供良好的基础；4、本专利技术构建的基因-病毒，是一种肿瘤特异性病毒，能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖和表达所携带的双抗癌基因，故该双基因-病毒具有很高的靶向抗癌作用；5、本专利技术构建的多种基因病毒经动物试验证明能选择性的杀死瘤细胞，而不影响正常细胞；基因-病毒表达的抗癌基因能加强病毒的抗肿瘤效果；这种新型的双基因-病毒靶向治疗，能基本上全部消除肿瘤，为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础。具体实施例方式以下通过具体实施例，以对本专利技术的肿瘤靶向双基因-病毒药物的制备方法作进一步说明。实验材料及原理1、基因(1)、肿瘤坏死因子超家族中的TRAIL基因；(2)、抑癌基因；(3)、细胞因子基因；(4)、促细胞凋亡基因；(5)、血管抑制基因；(6)、自杀基因；(7)、其他基因。其中，(1)肿瘤坏死因子基因肿瘤坏死因子超家族中的一员TRAIL，与细胞表面受体结合后，启动细胞凋亡途径，并选择性地促使肿瘤细胞凋亡；(2)抑癌基因抑癌基因包括p53、PTEN、Rb、NF1、VHL、APC，抑癌基因能够抑制肿瘤细胞的生长；(3)细胞因子基因白细胞介素-2、-12、-24，粒-单集落刺激因子，干扰素-α、-β、-γ；细胞因子具有杀伤肿瘤细胞，激活免疫细胞，增加造血功能等； (4)促细胞凋亡基因TRAIL、Bax、Caspase以及Smac等；细胞凋亡是多细胞生物生命活动的重要途径，细胞凋亡途径的异常是机体肿瘤发生的一个重要机制；抑制了细胞凋亡，肿瘤势必要发生；促细胞凋亡基因可加速肿瘤细胞的凋亡，是基因治疗肿瘤的有效基因；(5)血管抑制基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘新垣，裴子飞，邹卫国，楮亮，邱松坡，张紫莱，李兵华，冯琳，孙兰英，顾锦法，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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