一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种重组火鸡疱疹病毒，其具有同时表达NDV和IBDV保护性抗原基因的重组HVT，其是基于火鸡疱疹病毒(HVT)的细菌人工染色体(BAC)，利用基因重组技术先在HVT基因组的UL45‑46非必需区插入巨细胞病毒启动子CMV调控下的鸡传染性法氏囊病毒LX株的VP2基因表达盒，然后在HVT基因组的另一个非必须区US1‑10插入鸡β肌动蛋白启动子pec调控下的鸡新城疫病毒PX02/3株的F基因表达盒构建的。该重组火鸡疱疹病毒既可防控鸡马立克氏病，又可有效抵抗鸡新城疫及传染性法氏囊病的重组三联禽用疫苗候选株。

A recombinant turkey herpes virus and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因和鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒及其制备方法。
技术介绍
目前，全中国国家禽年出栏量约120亿只占世界饲养量20％左右，鸡80亿，水禽40亿，商品代蛋鸡平均存栏量为14.08亿只，全国禽肉产量为1867万吨，蛋产量为2394万吨左右。而我国每年实际上鸡的饲养量96亿只，也就是说每年至少有16亿只鸡在饲养过程中遭淘汰或死亡。这些接近20％的直接及间接死亡率大多数是传染病所造成的。因此说，目前我国对家禽传染病的防控现状并不令人乐观。在家禽的各种传染病中，病毒病依然是健康养鸡的最主要的威胁。当前鸡新城疫(NewcaslteDisease，ND)、传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)以及马立克氏病(Marek’sDisease，MD)成为我国养鸡业的主要传染病。这三种病分别被称为鸡的“艾滋病”、“鸡瘟”以及“淋巴癌”。它们的发病率和死亡率均为20-100％，而且经常在大范围内流行并曾在某些地区引起毁灭性打击，严重危害着养禽业的健康发展，因此举国的禽病工作者都在致力于构筑上述疫病的防控体系。在这个防控体系中，高效、优质的疫苗仍然是一个不可或缺的重要因素。它们包括以传统方法研制的灭活疫苗和减毒活疫苗以及利用现代生物学技术制备基因工程疫苗。传统方法制备的灭活疫苗产生的免疫力差、持续时间短，而减毒活疫苗的长期使用有可能毒力返强，诱发变异株，给养禽业带来新的潜在危害。这些先天性的缺陷使得传统疫苗已经越来越不适合国际健康养殖的新发展，所以应用现代生物技术研制基因工程疫苗是未来禽病防控的大势所趋。基因工程疫苗是将病原的保护性抗原编码的基因片段克隆入表达载体，用以转染细胞或真核细胞微生物及原核细胞微生物后得到的产物，或者将病原的毒力相关基因删除掉,使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。目前主要的基因工程疫苗包括重组亚单位疫苗、基因缺失苗、基因疫苗、重组活载体疫苗。重组活载体疫苗就是将一种或几种病原的保护性抗原基因插入到某个弱毒疫苗种子的基因组中，利用种子毒在体内表达出保护性抗原蛋白，并刺激机体产生相应的免疫力而制备的疫苗。如以禽痘病毒为载体的禽流感疫苗，然而，由于目前基因重组技术的局限性，人们很难将2个或2个以上的基因同时插入到一种弱毒疫苗种子基因组中并获得高效表达，致使目前尚未有HVT病毒为载体的三联重组禽病疫苗研制成功的报道。
技术实现思路
为解决现有技术的上述技术问题，本专利技术的提供一种重组火鸡疱疹病毒的转移载体，利用该转移载体构建了携带有鸡新城疫病毒F基因的重组HVT转移载体。本专利技术还提供一种重组火鸡疱疹病毒，该重组火鸡疱疹病毒可同时表达鸡新城疫病毒F基因和鸡传染性法氏囊病毒VP2基因，可用于作为防治鸡新城疫病和鸡传染性法氏囊病及鸡马立克氏病的疫苗。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种重组火鸡疱疹病毒的转移载体，该转移载体为具有氨苄青霉素抗性基因的重组HVT的转移载体pHVT-US1-10，其为含有US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的质粒，其携带有SalI和HindIII的酶切位点，所述US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。一种携带有鸡新城疫病毒F基因的重组HVT转移载体，将带有鸡β肌动蛋白启动子pec-NDVF-polyA的表达盒插入到如上所述的重组HVT的转移载体中，所述pec-NDVF-polyA的表达盒的序列如SEQIDNO.2所示。一种携带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组HVT转移载体，该转移载体为将两端设有PacI酶切位点的含人巨细胞病毒启动子表达VP2基因的CMV-VP2-BGHpolyA表达盒，插入到含有UL45-PacI-UL46基因片段的重组质粒，所述CMV-VP2-BGHpolyA表达盒的序列如SEQIDNO.3所示，所述UL45-PacI-UL46基因片段如SEQIDNO.4所示。一种重组火鸡疱疹病毒，该重组火鸡疱疹病毒可同时表达鸡新城疫病毒F基因和鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因，所述重组火鸡疱疹病毒含有pec-NDVF-polyA的表达盒和CMV-VP2-BGHpolyA表达盒；所述pec-NDVF-polyA的表达盒的序列如SEQIDNO.2所示，所述CMV-VP2-BGHpolyA表达盒的序列如SEQIDNO.3所示。如上所述重组火鸡疱疹病毒的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)、制备携带有鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-US-F，其含有重组火鸡疱疹病毒US1和US10基因及pec-NDVF-polyA表达盒；(2)、制备携带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-UL45-VP2-UL46，其含有重组火鸡疱疹病毒UL45和UL46基因及CMV-VP2-BGHpolyA表达盒；(3)、将步骤(2)中的pHVT-UL45-VP2-UL46采用NotI酶切，获得的UL45-CMV-VP2-BGHpolyA-UL46片段，将其电转化到含HVT-galkBAC质粒的感受态细胞中制备，获得携带鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组HVT细菌人工染色体的细菌HVT-VP2-BAC；(4)、利用所述步骤(3)制备获得的HVT-VP2-BAC感受态细胞，将两侧分别带有50bp的HVTUS1和US10基因序列的galK基因，电转化到所述HVT-VP2-BAC感受态细胞中，获得含HVT-VP2-galkBAC细菌；(5)、利用NotI酶切步骤(1)中所述重组HVT转移载体pHVT-US-F，获得US1-pec-F-polyA-US10基因片段，将该基因片段电转化入利用所述步骤(4)获得HVT-VP2-galkBAC细菌制备含HVT-VP2-galkBAC的感受态细胞中，获得重组HVT-VP2-FBAC的细菌。如上所述的制备方法，优选地，所述pec-NDVF-polyA的表达盒的获得是通过将NDVF基因插入到利用ECORI和XhoI酶切后的真核表达质粒pCAGGS中，之后采用SalI和HindⅢ限制性内切酶进行酶切获得；其中，所述NDVF基因的序列如SEQIDNO.5所示。如上所述的制备方法，优选地，在所述步骤(1)中，所述重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-US-F是由如下方法制备，将所述pec-NDVF-polyA的表达盒插入含有US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的转移载体中，所述US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。如上所述的制备方法，优选地，所述CMV-VP2-BGHpolyA表达盒的获得是通过将IBDVVP2片段插入利用KpnI和EcoRI酶切后的真核表达质粒pVAX1中，之后采用含PacI酶酶切位点序列的引物进行PCR扩增，进一步将上述PCR产物克隆于pGEM-T载体后进行PacI酶切获得；其中，所述IBDVVP2基因的序列如SEQIDNO.6所示。如上所述的制备方法，优选地，在所述步骤(2)中，重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-UL45-VP2-UL46是通过如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组火鸡疱疹病毒的转移载体，其特征在于，该转移载体为氨苄青霉素重组HVT的转移载体pHVT‑US1‑10，其为含有US1‑SalI‑HindIII‑US10的基因片段的质粒，其携带有SalI和HindIII的酶切位点，所述US1‑SalI‑HindIII‑US10的基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组火鸡疱疹病毒的转移载体，其特征在于，该转移载体为氨苄青霉素重组HVT的转移载体pHVT-US1-10，其为含有US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的质粒，其携带有SalI和HindIII的酶切位点，所述US1-SalI-HindIII-US10的基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。2.一种携带有鸡新城疫病毒F基因的重组HVT转移载体，其特征在于，将带有鸡β肌动蛋白启动子pec-NDVF-polyA的表达盒插入到如权利要求1所述的重组HVT的转移载体中，所述pec-NDVF-polyA的表达盒的序列如SEQIDNO.2所示。3.一种携带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组HVT转移载体，其特征在于，该转移载体为将两端设有PacI酶切位点的含人巨细胞病毒启动子表达VP2基因的CMV-VP2-BGHpolyA表达盒，插入到含有UL45-PacI-UL46基因片段的重组质粒，所述CMV-VP2-BGHpolyA表达盒的序列如SEQIDNO.3所示，所述UL45-PacI-UL46基因片段如SEQIDNO.4所示。4.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，该重组火鸡疱疹病毒可同时表达鸡新城疫病毒F基因和鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因，所述重组火鸡疱疹病毒含有pec-NDVF-polyA的表达盒和CMV-VP2-BGHpolyA表达盒；所述pec-NDVF-polyA的表达盒的序列如SEQIDNO.2所示，所述CMV-VP2-BGHpolyA表达盒的序列如SEQIDNO.3所示。5.如权利要求4所述重组火鸡疱疹病毒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：(1)、制备携带有鸡新城疫病毒F基因的重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-US-F，其含有重组火鸡疱疹病毒US1和US10基因及pec-NDVF-polyA表达盒；(2)、制备携带有鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒转移载体pHVT-UL45-VP2-UL46，其含有重组火鸡疱疹病毒UL45和UL46基因及CMV-VP2-BGHpolyA表达盒；(3)、将步骤(2)中的pHVT-UL45-VP2-UL46采用NotI酶切，获得的UL45-CMV-VP2-BGHpolyA-UL46片段，将其电转化到含HVT-galkBAC质粒的感受态细胞中制备，获得携带鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组HVT细菌人工染色体的细菌H...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永清，许健，江波，黄秀芬，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11