用于检测抗弹状病毒抗体的多肽制造技术

本发明专利技术涉及用于分析测定的重组构建的蛋白质，特别是用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体。更具体地，本发明专利技术涉及包含弹状病毒糖蛋白的胞外结构域和与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域的多肽。在一个实施例中，提供了式x

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测抗弹状病毒抗体的多肽


[0001]本专利技术涉及用于分析测定的重组构建的蛋白质，特别是用于确定从个体获得的生物样品中是否存在弹状病毒特异性抗体。
[0002]背景信息
[0003]弹状病毒是属于弹状病毒科的具有包膜的负链RNA病毒。弹状病毒病毒体包含源自产生病毒的细胞的外膜和包含非分段基因组RNA和N蛋白(nucleocapsid protein，核衣壳蛋白)的内部核糖核蛋白核心。弹状病毒糖蛋白(glycoprotein，G)跨越外膜并在病毒颗粒表面形成刺突。已知弹状病毒糖蛋白对病毒传播至关重要，因为它在病毒入胞过程中具有受体结合和膜融合的功能。病毒基质蛋白(matrix protein，M)分子位于病毒包膜内，并形成在膜和核衣壳核心之间的层。非结构蛋白包括L蛋白(large protein，大蛋白)和P蛋白(phosphoprotein，磷蛋白)，它们形成病毒转录酶
‑
复制酶复合物。
[0004]弹状病毒广泛分布于自然界中，可以感染脊椎动物、无脊椎动物和植物。原型弹状病毒是狂犬病毒(rabies virus，RV)和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)，它们被认为是该病毒家族中研究最多的病毒。2014年，据报道发现了一种能够感染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf)细胞的新型弹状病毒，被称为Sf
‑
弹状病毒(Sf
‑
rhabdovirus，SfRV)(Ma等人，J Virol，88(12)：6576
‑
6585)。在WO2015051255A1中，描述了通过PCR测定来检测这种病毒。
[0005]事实上，对于诸如ELISA的固相测定，需要将一定量的抗原固定在固体支持物上，需要在细胞培养中以尽可能高的产率生产的抗原，以降低每次测定的成本并减少不经济的浪费。
[0006]因此，关于用于检测弹状病毒特异性抗体的固相测定的生产，需要多肽，其在细胞培养中以尽可能高的产率生产，同时在进行测定时保留充分结合所述抗体所必需的抗原性。
[0007]专利技术详述
[0008]上述技术问题的解决方案通过说明书和权利要求书中的实施方案来实现。
[0009]因此，本专利技术在其不同方面是根据权利要求书来实施的。
[0010]本专利技术基于以下出人意料的发现：将SfRV糖蛋白的胞外结构域的C
‑
端，优选在第306位和第333位氨基酸处具有取代的SfRV糖蛋白的胞外结构域的C
‑
端，融合到IgG Fc结构域，使得当与具有野生型序列的相应胞外结构域的表达相比时，具有显著更高摩尔产率的抗原表达，该抗原可用于检测血清样品中对SfRV特异的抗体。与使用野生型序列的比对测试生产相比，这种有益效果还允许以相同的蛋白质表达成本进行显著更多数量的ELISA测试。
[0011]因此，在第一方面，本专利技术涉及一种多肽，其包含
[0012]弹状病毒糖蛋白的胞外结构域和
[0013]与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域。
[0014]所述多肽，在下文中也称为“本专利技术的多肽”，优选用于确定从个体获得的生物样
品中是否存在对弹状病毒具有特异性的抗体。
[0015]如本文所用，术语“胞外结构域”旨在涵盖位于病毒包膜外表面上的蛋白质部分。例如，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是弹状病毒糖蛋白延伸到病毒外空间的那部分。更具体地，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是其中跨膜螺旋和细胞质结构域已被去除的弹状病毒糖蛋白。更优选地，弹状病毒糖蛋白的胞外结构域是其中跨膜螺旋、细胞质结构域和N
‑
端信号肽已被去除的弹状病毒糖蛋白。
[0016]如在本专利技术的上下文中使用的术语“多聚化结构域”特别涉及能够特异性结合或缔合一个或多个进一步的多聚化结构域以形成多聚体的氨基酸序列。在一个实施例中，多聚化结构域是一种氨基酸序列，其能够结合或分别与另一个具有相同氨基酸序列的多聚化结构域同源缔合以形成同源二聚体。多聚化结构域可以包含一个或多个半胱氨酸残基，从而可以在相关的多聚化结构域之间形成二硫键。
[0017]在本文中，“异源多聚化结构域”特别涉及衍生自不同于如本文所述弹状病毒糖蛋白所来自的弹状病毒的实体的多聚化结构域。例如，异源多聚化结构域是由除弹状病毒之外的病毒基因组或优选由真核细胞或原核细胞特别是哺乳动物细胞的基因组编码的多聚化结构域。
[0018]优选地，多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接。
[0019]如在本专利技术上下文中所述的接头部分优选是肽接头。
[0020]如本文所用，术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸残基的肽。更具体地，如本文所用的术语“肽接头”是指能够连接两个可变结构域(例如，胞外结构域和多聚化结构域)的肽，其长度取决于要连接的可变结构域的种类。
[0021]在一个特别优选的方面，多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接，其中
[0022]‑
多聚化结构域通过接头部分的N
‑
端氨基酸残基和胞外结构域的C
‑
端氨基酸残基之间的肽键连接到接头部分，并且
[0023]‑
接头部分通过多聚化结构域的N
‑
端氨基酸残基和接头部分的C
‑
端氨基酸残基之间的肽键连接至多聚化结构域。
[0024]此外，优选多聚化结构域通过多聚化结构域的N
‑
端氨基酸残基和胞外结构域的C
‑
端氨基酸残基之间的肽键连接至胞外结构域。
[0025]在另一个优选的方面，本专利技术提供了一种多肽，特别是如上所述的多肽，其中所述多肽是式x
‑
y
‑
z的融合蛋白，其中
[0026]x由弹状病毒糖蛋白的胞外结构域组成或包含弹状病毒糖蛋白的胞外结构域；
[0027]y是接头部分；并且
[0028]z是异源多聚化结构域。
[0029]式x
‑
y
‑
z尤其应理解为所述胞外结构域的C
‑
端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选通过肽键与所述接头部分的N
‑
端氨基酸残基连接，并且所述多聚化结构域的N
‑
端氨基酸残基与所述接头部分连接，优选通过肽键与所述接头部分的C
‑
端氨基酸残基连接。
[0030]最优选地，本专利技术上下文中在此提及的胞外结构域不含弗林蛋白酶切割位点。“不含弗林蛋白酶切割位点”特别是指在胞外结构域的氨基酸序列中不存在弗林蛋白酶切割位点。
[0031]如本文所述，弗林蛋白酶切割位点特别是选自以下(a)、(b)和(c)的氨基酸序列：
[0032](a)选自RXKR(SEQ ID NO:20)和RXRR(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸残基；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，包含
‑
弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，和
‑
与所述胞外结构域连接的异源多聚化结构域。2.权利要求1所述的多肽，其中所述异源多聚化结构域通过接头部分与所述胞外结构域连接，或其中所述异源多聚化结构域通过其N端氨基酸残基和所述胞外结构域的C端氨基酸残基之间的肽键与所述胞外结构域连接。3.一种多肽，特别地是权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽是式x
‑
y
‑
z的融合蛋白，其中x由弹状病毒糖蛋白的胞外结构域组成或包含弹状病毒糖蛋白的胞外结构域；y是接头部分；z是异源多聚化结构域。4.权利要求1
‑
3中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域不含弗林蛋白酶切割位点，并且其中所述弗林蛋白酶切割位点优选为选自以下(a)、(b)和(c)的氨基酸序列：(a)选自RXKR(SEQ ID NO:20)和RXRR(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列；(b)选自RX1KRX2(SEQ ID NO:22)和RX1RRX2(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列，其中X1可以是任何氨基酸残基，并且X2可以是
‑
除赖氨酸残基外或
‑
除选自缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基外的任何氨基酸残基；(c)选自RX1KRX2X3(SEQ ID NO:24)和RX1RRX2X3(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列，其中X1可以是任何氨基酸残基，X2可以是
‑
除赖氨酸残基外或
‑
除选自缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基和色氨酸残基的氨基酸残基外的任何氨基酸残基；X3可以是除赖氨酸残基之外的任何氨基残基。5.权利要求1
‑
4中任一项所述的多肽，其中所述胞外结构域是SF
‑
弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有(i)选自第306位氨基酸的取代、第303位氨基酸的取代、第305位氨基酸的取代、第307位氨基酸的取代和第308位氨基酸的取代的一种或多种突变，以及(ii)选自第333位氨基酸的取代、第330位氨基酸的取代、第332位氨基酸的取代、第334位氨基酸的取代和第335位氨基酸的取代的一种或多种突变，其中氨基酸位点的编号根据野生型SF
‑
弹状病毒糖蛋白的氨基酸序列，和/或其中所述胞外结构域是SF
‑
弹状病毒糖蛋白的胞外结构域，其具有
‑
在第306位氨基酸处除精氨酸残基之外的氨基酸残基，和/或
NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％、还更优选地至少9...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：