用于针对轮状病毒疫苗接种的融合蛋白质制造技术

本发明专利技术是关于以重组方式构建的多肽，其用于制备具体用于减少由轮状病毒感染引起之一或多种临床症状的疫苗。更具体地，本发明专利技术是关于一种在N端至C端方向上包含以下的融合蛋白质：(i)轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，诸如IgG Fc片段，其中该融合蛋白质可用于减少由猪中轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中。法中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于针对轮状病毒疫苗接种的融合蛋白质


[0001]本专利技术关于以重组方式构建的多肽，其用于制备疫苗，特别是用于减少由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状。更特别是，本专利技术系关于一种在N端至C端方向上包含以下的融合蛋白质：(i)轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，诸如IgG Fc片段，其中该融合蛋白质可用于减少由猪中的轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中。
【现有技术】
[0002]轮状病毒为包含呼肠孤病毒科(Reoviridae)内的病毒属的双股RNA病毒。已知轮状病毒感染会引起肠胃疾病且视为婴儿的胃肠炎的最常见原因。轮状病毒系通过粪便
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经口途径传播且感染穿过小肠的细胞。受感染细胞产生肠毒素，其诱发胃肠炎，导致严重腹泻且有时经由脱水死亡。
[0003]轮状病毒具有由11个双股RNA(dsRNA)区段构成的基因组，且当前基于如通过国际病毒分类委员会(International Commitee on Taxonomy of Viruses；ICTV)定义且由Matthijnssens等人(Arch Virol 157:1177
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1182(2012))概述的内部病毒衣壳蛋白6(VP6)的抗原特性及基于序列的分类分为八组(A
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H)，其中本文所提及的此公开案及以下公开案以全文引用的方式并入。
[0004]轮状病毒的基因组编码六种结构蛋白(VP 1
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VP4、VP6及VP7)及六种非结构蛋白(NSP 1
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NSP6)，其中基因组区段1
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10各自编码一种轮状病毒蛋白质，且基因组区段11编码两种蛋白质(NSP5及NSP6)。
[0005]在轮状病毒A的情况下，不同病毒株可基于结构蛋白VP7及VP4分类为基因型(由比较序列分析和/或核酸杂交数据定义)或血清型(由血清学分析定义)。VP7及VP4为最外部蛋白质层的组分(外部衣壳)，且两者均携带中和抗原表位。VP7为形成病毒粒子的外层或表面的醣蛋白(因此称为“G”)。VP7确定病毒株的G型及G血清型及G基因型的名称相同。VP4为蛋白酶敏感的(因此称为“P”)且确定病毒的P型。与G型相比，针对P血清型及基因型指定的数字不同(Santos N.et Hoshino Y.,2005,Reviews in Medical Virology,15,29
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56)。因此，P血清型表示为P，接着指定为数字，且P基因型表示为P，接着指定为括号中的数字(例如，“P[7]”或“P[13]”)。属于相同基因型的病毒株具有高于89％氨基酸序列一致性(Estes及Kapikian.Rotaviruses.在Knipe,D.M.；Howley,P.M.Fields Virology,第5版；Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Wilkins Health:Philadelphia,PA,USA(2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):7155
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9(1990)中)。
[0006]轮状病毒尤其亦为具有针对几乎100％猪中所存在的A族及C族轮状病毒的抗体的猪的胃肠炎的主要原因(Vlasova等人Viruses.9(3):48(2017))。当前，仅针对轮状病毒A可获得经修饰的存活或经杀灭疫苗。无法在实验室中培养轮状病毒C会妨碍研发针对此群的疫苗，随后增加重组疫苗的吸引性。
[0007]重组抗轮状病毒疫苗的产生受轮状病毒衣壳的复杂性阻碍，该轮状病毒衣壳由配
置于三个层中的四种蛋白质构成。最内层由60个具有T＝1对称性的VP2二聚体构成。对于中间层的恰当排序，需要VP2层，其由260个具有T＝13对称性的VP6三聚体形成。VP2与VP6之间的所得对称性错配产生五个不同的VP6三聚体位置及三种不同孔径类型。在VP2不存在的情况下，VP6易于以可表示病毒组装的副产物的盐及pH依赖性方式形成有序高分子量微管及球状体。在衣壳中，VP6层由VP7的260个Ca2+依赖性三聚体覆盖，其充当使VP4刺突蛋白保持在适当位置的夹具。VP7为糖基化的或G型抗原，且含有中和抗原表位。大部分中和抗体仅识别三聚VP7且被认为通过防止VP7三聚体解离而起作用，其反过来阻断刺突蛋白的释放。轮状病毒刺突蛋白以60个VP4的三聚体形式存在，其仅在II型孔隙处插入VP6层中。VP4含有中和抗原表位且为P型抗原，通过胰蛋白酶裂解为刺突蛋白碱基VP5*及细胞相互作用头VP8*，其在裂解后保持与VP5*相关。胰蛋白酶消化进入刺突蛋白用于细胞进入，在此期间该刺突蛋白经历深入的结构重排以暴露用于宿主细胞上的受体结合的活性位点。忽略以上组装方法的复杂性，难以达成在环境条件下将轮状病毒衣壳蛋白的化学计算量表达促进适当组装。
[0008]鉴于轮状病毒衣壳组装的困难，对亚单位疫苗方法感兴趣。VP7及VP4为含有中和抗原表位的两种蛋白质，然而VP7的使用将由于其糖基化及钙依赖性三聚而变得复杂。VP4的使用因其三聚、胰蛋白酶消化及潜在构形状态范围而变得复杂。VP8蛋白质，亦称为VP8结构域或VP8*，其通过VP4的胰蛋白酶消化产生，含有中和抗原表位，为单体，其结构测定为高分辨率(Dormitzer等人EMBO J.21(5):885
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897(2002))且描述为高度稳定的。
[0009]此外，在VP8蛋白质内，被视为与宿主受体相互作用且涉及病毒附着至宿主细胞的凝集素样结构域(aa65
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224)(Rodriguez等人,PloS Pathog.10(5):e1004157(2014))。
[0010]已描述研发针对儿童的轮状病毒亚单位疫苗的方法，其中N端连接至破伤风类毒素通用CD4
+
T细胞抗原表位(aa830
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844)P2的截短VP8蛋白质(VP8*氨基酸残基64(或65)
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223)产生于大肠杆菌中(Wen等人Vaccine.32(35):4420
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7(2014))，且在婴儿及幼童中测试(Groome等人Lancet Infect Dis.17(8):843
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853(2017))。然而，由于此使用单价亚单位疫苗(基于轮状病毒基因型P[8]的截短VP8蛋白质)引发针对异型轮状病毒病毒株的不良反应，因此最近亦测试三价疫苗调配物(包含用于组合基因型P[4]、P[6]、P[8]抗原的三种蛋白质)(Groome等人Lancet Infect Dis.S1473
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3099(20)30001(2020))。
[0011]在另一方法中，N端截短VP8蛋白质，即“VP8
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1”(aa26
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241)的N端或C端与霍乱毒素(CTB)的五聚无毒性B亚单位融本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，其包含
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轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，及
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免疫球蛋白Fc片段。2.如权利要求1的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，或其中该免疫球蛋白Fc片段经由该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。3.一种多肽，特别是如权利要求1或2的多肽，其中该多肽为式x
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y
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z的融合蛋白质，其中x由轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段组成；y为接头部分；并且z为免疫球蛋白Fc片段。4.如权利要求1
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3中任一项的多肽，其中该轮状病毒为猪轮状病毒，和/或其中该轮状病毒选自由以下组成的群：轮状病毒A及轮状病毒C。5.如权利要求1
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4中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段为轮状病毒VP8蛋白质的N端延伸的凝集素样结构域，其中该N端延伸的长度为1至20个氨基酸残基，优选5至15个氨基酸残基。6.如权利要求1
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5中任一项的多肽，其中该轮状病毒选自由以下组成的群：基因型P[7]轮状病毒、基因型P[6]轮状病毒及基因型P[13]轮状病毒。7.如权利要求1
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6中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由以下组成或为以下的共有序列：轮状病毒VP8蛋白质的一部分，特别是轮状病毒A VP8蛋白质的一部分，且其中轮状病毒VP8蛋白质的一部分的该共有序列优选可通过包含以下步骤的方法获得：
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将多个编码轮状病毒VP8蛋白质的一部分的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，
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将所述氨基酸序列与已知轮状病毒VP8蛋白质比对，优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类法及预设空隙罚分参数，
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对所述比对序列进行种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，特别是将所述比对氨基酸序列导入MEGA7软件以用于种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，
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使用泊松(Poisson)校正法以及种系发生的自助重抽检验来计算最优树(n＝100)，
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按比例绘制最优树，其中分支长度等于在总共170个位置上以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
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将自助重抽聚类关联大于70％的节点作为显著的，
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将具有大致10％距离及大于70％的自助重抽聚类关联的节点指定为聚类，以及
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选择聚类及通过鉴别该聚类内每个比对位置的最大频率来产生共有序列，
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且视情况，在其中在比对位置中观测到相等比例的氨基酸的情况下，基于所报导的流行病学数据以及预定产品保护概况选择氨基酸残基。
8.如权利要求1
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7中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。9.如权利要求1
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8中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段为由其肠道细胞易受该轮状病毒感染的物种的基因组编码的免疫球蛋白Fc片段，轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段衍生自该轮状病毒，和/或其中该免疫球蛋白Fc片段优选为猪IgG Fc片段，和/或其中该免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的氨基酸序列。10.如权利要求1
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9中任一项的多肽，其中该接头部分为长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列，和/或其中该接头部分包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11组成的群的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的氨基酸序列。11.如权利要求2
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10中任一项的多肽，其中该多肽包含连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选经由接头部分连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端，其中该接头部分特别是为如权利要求10中所指定的接头部分，或其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段经由轮状病毒VP8蛋白质的该...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健有限公司，
类型：发明
国别省市：