AAV衣壳-启动子相互作用和细胞选择性基因表达制造技术

本文公开了用于基因疗法的方法和组合物，特别是涉及衣壳蛋白序列的改变的方法和组合物，所述改变用于当启动子和所述衣壳蛋白存在于细胞内并且所述衣壳蛋白和所述启动子处于重组腺相关病毒颗粒(AAV)的背景下时改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。启动子在所述细胞内的允许作用。启动子在所述细胞内的允许作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AAV衣壳
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启动子相互作用和细胞选择性基因表达
[0001]优先权声明
[0002]本申请要求2020年2月18日提交的美国临时申请序列号62/977,838和2020年5月11日提交的美国临时申请序列号63/023,003的权益，所述美国临时申请中每一个的全部内容以引用方式并入本文。
[0003]政府支持
[0004]本专利技术是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)拨款的基金号NS082289的政府支持下完成。政府拥有本专利技术中的某些权利。


[0005]本专利技术涉及用于基因疗法的方法和组合物。特定地说，本专利技术涉及当启动子和衣壳蛋白存在于细胞内并且衣壳蛋白和启动子处于重组腺相关病毒颗粒的背景下时改变所述启动子在所述细胞内的允许作用的方法和组合物。

技术介绍

[0006]鉴于高度有利的体内性质，腺相关病毒(AAV)载体已在临床前和临床基因疗法研究中发挥了突出作用。重要的是，对于许多应用来说，成功的结果取决于实现细胞转导和基因表达的特定性质。实现选择性载体性质的一种手段涉及基于衣壳在细胞结合、胞内体逃逸和核定位中的作用来操作AAV衣壳结构。AAV衣壳基因编码三种结构蛋白(VP1、VP2和VP3)，所述蛋白以1:1:10的比率组装到衣壳中。VP1和VP2具有不在VP3中的独特N末端序列，而VP3序列(C末端)在所有VP蛋白中是共有的(Buller等，J.Virol.25:331(1978)；Johnson等，J.Virol.8:860(1971)；Rose等，J.Virol.8:766(1971))。衣壳的操作主要通过使用基本诱变或衣壳DNA改组而集中于VP3序列。在衣壳DNA改组的情况下，通过DNA改组或易错PCR来操作AAV衣壳DNA会产生含有大量多样性的AAV衣壳文库(Asokan等，Mol.Ther.20:699(2012))。随后在体外或体内施用该文库提供了挽救新颖衣壳的手段，所述衣壳满足由定向演化参数施加的特定选择压力。例如，已生成有效转导神经干细胞(Jang等，Mol.Ther.19:667(2011))或少突胶质细胞(Powell等，Gene Ther.23:807(2016))的新颖衣壳。
[0007]尽管衣壳工程改造集中于操作VP3，但最近的研究表明，包括VP1和VP2在内的衣壳蛋白可影响细胞基因表达。Johnson等(J.Virol.84:8888(2010))确认AAV2 VP2衣壳中的突变显著改变体外基因表达。类似地，Aydemir等(J.Virol.90:7196(2016))报道了AAV2衣壳表面上“死区”中的单点突变体产生包装的AAV载体，所述AAV载体展现出正常的受体结合、细胞内运输和在细胞核中的适当脱壳，但未能转录基因。这些研究讨论了AAV衣壳可能对细胞基因表达施加重大影响。然而，仍然需要发现修饰从AAV载体的转基因表达的新方式，以克服本领域当前的缺点。

技术实现思路

[0008]本专利技术的方面涉及发现AAV衣壳蛋白在不同细胞类型中的启动子活性中的先前未
知的作用。研究表明，衣壳蛋白的特定区域可改变病毒基因组从可操作地连接的启动子的体内细胞基因表达，并且这种改变影响表达发生的细胞类型。我们已鉴别出AAV衣壳与启动子之间先前未知的相互作用，这种相互作用可在体内提供选择性细胞基因表达，并进一步教导如何操作这种相互作用(例如，通过修饰衣壳蛋白)以影响从AAV载体的细胞类型表达。
[0009]因此，本专利技术的一个方面涉及AAV衣壳蛋白或其衍生物，其包含AAV VP1/VP2边界的至少一部分，所述衣壳蛋白包含在所述VP1/VP2边界内的一个或多个氨基酸处的氨基酸序列修饰，当启动子和所述衣壳蛋白存在于细胞内并且其中所述衣壳蛋白和所述启动子在重组AAV颗粒的背景下时，所述氨基酸序列修饰改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。
[0010]本专利技术的又一方面涉及用于改变可操作地连接到启动子并通过rAAV载体递送到细胞的转基因的表达的方法，所述方法包括修饰所述rAAV载体的衣壳蛋白或其衍生物的VP1/VP2边界内的至少一个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列修饰改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。
[0011]本专利技术的另一方面涉及编码AAV衣壳蛋白或其衍生物的核酸，所述AAV衣壳蛋白或其衍生物包含AAV VP1/VP2边界的至少一部分，所述衣壳蛋白包含在所述VP1/VP2边界内的一个或多个氨基酸处的氨基酸序列修饰，当启动子和所述衣壳蛋白存在于细胞内并且其中所述衣壳蛋白和所述启动子在重组AAV颗粒的背景下时，所述氨基酸序列修饰改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。
[0012]本专利技术的另一方面涉及包含本专利技术核酸的载体、细胞、病毒颗粒和AAV颗粒。
[0013]本专利技术的又一方面涉及产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，所述方法包括：向体外细胞提供根据本专利技术的核酸、AAV rep编码序列、包含可操作地连接到异源核酸的启动子的AAV载体基因组和用于生成生产性AAV感染的辅助功能物(helper function)；以及允许组装包含所述AAV衣壳并将所述AAV载体基因组衣壳化的所述重组AAV颗粒。
[0014]本专利技术的另一方面涉及药物配制剂，其包含在药学上可接受的载剂中的本专利技术的AAV衣壳蛋白或其衍生物、核酸、病毒颗粒或AAV颗粒。
[0015]本专利技术的另一方面涉及将目的核酸递送到中枢神经系统(CNS)细胞的方法，所述方法包括使细胞与本专利技术的AAV颗粒接触。
[0016]本专利技术的又一方面涉及将目的核酸递送到哺乳动物受试者的细胞的方法，所述方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的本专利技术的AAV颗粒或药物配制剂，由此将所述目的核酸递送到所述哺乳动物受试者的细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者的CNS中。
[0017]本专利技术的另一方面涉及治疗有需要的哺乳动物受试者的病症的方法，其中所述病症可通过在所述受试者的细胞(例如，CNS细胞)中表达治疗性产物来治疗，所述方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本专利技术的AAV颗粒或药物配制剂，其中所述产物被表达，由此治疗所述病症。
[0018]本专利技术的另一方面涉及改变存在于AAV载体中的异源多核苷酸在受试者的细胞中的表达的方法，其包括用本专利技术的AAV衣壳蛋白或其衍生物制备所述AAV载体，以及向所述受试者施用所述AAV载体，以由此接触所述受试者的所述细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者的CNS中。
[0019]本专利技术的这些和其他方面更详细地陈述于以下本专利技术的说明中。
附图说明
[0020]图1A
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图1B显示用于驱动报道基因表达的两种组成型启动子(CBA和CBh)的组分图解。1A显示CBA(1.6kb)和CBh(0.8kb)启动子的共有元件：CMV早期启动子、鸡β
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肌动蛋白启动子和鸡β
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肌动蛋白内含子。CBh启动子具有截短的鸡β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白或其衍生物，其包含AAV VP1/VP2边界的至少一部分，所述衣壳蛋白包含在所述VP1/VP2边界内的一个或多个氨基酸处的氨基酸序列修饰，当启动子和所述衣壳蛋白存在于细胞内并且其中所述衣壳蛋白和所述启动子在重组AAV颗粒的背景下时，所述氨基酸序列修饰改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述VP1/VP2边界对应于AAV9 VP1(SEQ ID NO:14)的氨基酸110
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170。3.根据权利要求1或2所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰改变形成所述颗粒的所述衣壳的所述VP1/VP2边界的静电荷，由此改变所述启动子在所述细胞内的所述允许作用。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰包括选自由以下组成的组的突变：插入、缺失、取代和其组合。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰包括在对应于AAV9 VP1(SEQ ID NO:14)的120到150的一个或多个氨基酸处的修饰。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述细胞是神经元细胞或神经胶质细胞。7.根据权利要求6所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述神经元细胞是中型多棘神经元、胆碱能中间神经元或γ
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氨基丁酸能中间神经元。8.根据权利要求6所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述启动子是泛素启动子。10.根据权利要求1
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8中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述启动子是组织特异性启动子。11.根据权利要求1
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11中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是1
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20个氨基酸残基、4
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16个氨基酸残基、6
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14个氨基酸残基或3
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200个氨基酸残基的插入。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是3个或更多个氨基酸残基的插入。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰保留了存在于所述衣壳蛋白中的核定位信号和磷脂酶结构域。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是对VP2的氨基酸序列的修饰。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是在对应于AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:14)的137和138的氨基酸之间的插入或在对应于AAV9衣壳蛋白(SEQ ID NO:14)的138和139的氨基酸之间的插入。16.根据权利要求1
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15中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰增加少突胶质细胞中从所述启动子的表达和/或减少神经元中从所述启动子的表达。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是具有总体负电荷的残基的插入。
18.根据权利要求17所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是2个或更多个谷氨酸残基的插入。19.根据权利要求18所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是6个谷氨酸残基的插入。20.根据权利要求1
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16中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是具有总体正电荷的残基的插入。21.根据权利要求20所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是P物质肽的插入。22.根据权利要求1
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15中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰增加神经元中从所述启动子的表达和/或减少少突胶质细胞中从所述启动子的表达。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是具有总体中性电荷的残基的插入。24.根据权利要求23所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是2个或更多个丙氨酸残基的插入。25.根据权利要求24所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述氨基酸序列修饰是6个丙氨酸残基的插入。26.根据权利要求1
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25中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述衣壳蛋白来自选自由以下组成的组的血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。27.根据权利要求26所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述衣壳蛋白来自AAV2。28.根据权利要求26所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述衣壳蛋白来自AAV8。29.根据权利要求26所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述衣壳蛋白来自AAV9。30.根据权利要求1
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26中任一项所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述rAAV颗粒选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。31.根据权利要求30所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述rAAV颗粒是AAV2。32.根据权利要求30所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述rAAV颗粒是AAV8。33.根据权利要求30所述的AAV衣壳蛋白或其衍生物，其中所述rAAV颗粒是AAV9。34.一种用于改变可操作地连接到启动子并通过rAAV载体递送到细胞的转基因的表达的方法，所述方法包括修饰所述rAAV载体的衣壳蛋白或其衍生物的VP1/VP2边界内的至少一个氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列修饰改变所述启动子在所述细胞内的允许作用。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述VP1/VP2边界对应于AAV9(SEQ ID NO:14)的氨基酸110
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170。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰改变形成所述颗粒的所述衣壳的所述VP1/VP2边界的静电荷，由此改变所述启动子在所述细胞内的所述允许作用。37.根据权利要求34
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36中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰包括选自由以下组成的组的突变：插入、缺失、取代和其组合。
38.根据权利要求34
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37中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰包括在对应于AAV9 VP1(SEQ ID NO:14)的120到150的一个或多个氨基酸处的修饰。39.根据权利要求34
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38中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞或神经胶质细胞。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述神经元细胞是中型多棘神经元、胆碱能中间神经元或γ
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氨基丁酸能中间神经元。41.根据权利要求39所述的方法，其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。42.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是泛素启动子。43.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子。44.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是CBA启动子。45.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是CBh启动子。46.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是JeTI启动子。47.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是突触蛋白启动子。48.根据权利要求34
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41中任一项所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子和鸡β
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肌动蛋白(CAG)、巨细胞病毒(CMV)、CMV/鸡β
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肌动蛋白(CMV/β
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肌动蛋白)、延伸因子1α(EF1α)、磷酸甘油酸激酶、泛素C(UbC)、CB、CBA和CBh、JeTI、人突触蛋白启动子(hSYN1)、巨细胞病毒(CMV)启动子或CB7启动子、人β
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肌动蛋白启动子、人延长因子
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1α启动子、猿病毒40启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、二氢叶酸还原酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、红
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绿视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子、光感受器间结合蛋白(IRBP)启动子和cGMP
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β
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磷酸二酯酶启动子、噬菌体λ(PL)启动子、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、四环素控制的反式激活子应答性启动子(tet)系统、莫洛尼鼠肉瘤病毒的U3区启动子、颗粒酶A启动子、金属硫蛋白基因的一个或多个调控序列、CD34启动子、CD8启动子、胸苷激酶(TK)启动子、B19细小病毒启动子、PGK启动子、糖皮质激素启动子、诸如HSP65和HSP70启动子的热休克蛋白(HSP)启动子、免疫球蛋白启动子、MMTV启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、lac启动子、CaMV 35S启动子、胭脂碱合成酶启动子、MND启动子或MNC启动子、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)启动子、α1
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抗胰蛋白酶(AAT)启动子、白蛋白启动子、乙型肝炎病毒核心启动子、甲状腺素结合球蛋白(TGB)启动子和LSP1启动子、骨骼β
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肌动蛋白启动子、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶、肝(白蛋白)启动子、乙型肝炎病毒核心启动子、甲胎蛋白(AFP)、骨钙素、骨涎蛋白、淋巴细胞(CD2)、免疫球蛋白重链、T细胞受体链、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、神经丝轻链基因启动子、神经元特异性vgf基因启动子、Synapsinl、CaMKIIα、GAD67、GAD65、VGAT、SP
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B启动子、ICAM启动子、IFNβ启动子、CD45启动子、OG
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2启动子、NSE启动子、MSK启动子、JeTI、SPc5
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12、2R5Sc5
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12、dMCK、tMCK、SP1元件、合成冷休克应答性启动子(钙周期蛋白)、sps5、sps8、来自于YGP1基因的在酸性条件下可诱导的合成启动子、来源于CCW14基因的在酸性条件下可诱导的合成启动子、YGP1pr、tTA、tTA依赖性启动子、枯茗酸诱导型启动子、4
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羟基他莫昔芬(OHT)诱导型启动子、金属硫蛋白诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子或诱导型启动子。49.根据权利要求34
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48任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是1
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20个氨基酸
残基、4
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16个氨基酸残基、6
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14个氨基酸残基或3
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200个氨基酸残基的插入。50.根据权利要求34
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49中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是3个或更多个氨基酸残基的插入。51.根据权利要求34
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50中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰保留了存在于所述衣壳蛋白中的核定位信号和磷脂酶结构域。52.根据权利要求34
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51中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是对VP2的氨基酸序列的修饰。53.根据权利要求34
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52中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是在对应于AAV9(SEQ ID NO:14)的137和138的氨基酸之间的插入或在对应于AAV9(SEQ ID NO:14)的138和139的氨基酸之间的插入。54.根据权利要求34
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53中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰增加少突胶质细胞中从所述启动子的表达和/或减少神经元中从所述启动子的表达。55.根据权利要求34
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54中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是具有总体负电荷的残基的插入。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是2个或更多个谷氨酸残基的插入。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是6个谷氨酸残基的插入。58.根据权利要求34
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54中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列修饰是具有总体正电荷的残基的插入。59.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校，
类型：发明
国别省市：