修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途制造技术

本发明专利技术提供了突变的血清5型腺相关病毒(AAV5)，其表现出衣壳特性的改变，例如，在人肝细胞中的感染性增加和/或与人类中和抗体的结合最小。本发明专利技术还提供了在衣壳基因中包含一种或更多种突变的突变AAV5库。本发明专利技术还提供了产生突变AAV5和突变AAV5库的方法，以及包含所述突变AAV5的组合物。本发明专利技术还提供了包含突变衣壳蛋白的重组AAV5(rAAV5)病毒粒子。本发明专利技术还提供了包含编码突变衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸。核酸。核酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的腺相关病毒5衣壳及其用途
[0001]优先权声明
[0002]本申请依据35U.S.C.
§
119(e)要求2020年5月5日提交的美国临时申请序号63/020,139的权益，其所述的全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于序列表电子提交的声明
[0004]按37C.F.R.
§
1.821提交的ASCII文本格式的序列表被提供以替代纸质副本，其标题为5470
‑
881_ST25.txt，大小为56,036字节，于2021年4月26日生成，并通过EFS
‑
Web提交。本序列表在此通过引用并入本说明书以将其公开。


[0005]本专利技术属于重组腺相关病毒载体领域。
[0006]专利技术背景
[0007]腺相关病毒(AAV)是一种4.7kb的单链DNA病毒，其基因组由两个开放阅读框rep和cap组成，其两端有反向末端重复序列(ITR)。rep基因编码病毒DNA复制和包装所必需的四种rep蛋白，且cap基因编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，它们以1:1:10的比例相互作用形成衣壳。迄今为止，已经发现了许多AAV血清型，所有血清型都对人体细胞和器官具有不同的嗜性。
[0008]在过去的几十年里，基于AAV的基因疗法取得了实质性进展，导致许多具有里程碑意义的临床试验和在治疗各种遗传性疾病方面引人注目的成功。大量的临床试验结果表明，基于AAV的疗法是安全和有效的。此外，基于AAV的基因疗法能够在人体的许多器官和组织中进行有效的基因递送和持久的基因表达。尤其是，基于AAV的基因疗法已被证明对于治疗肝脏遗传病，如血友病非常有前途，因为多种AAV血清型能够有效感染肝脏，并提供所需转基因的稳定表达。
[0009]尽管基于AAV的基因疗法取得了成功，但阻碍基因疗法平台发挥其全部潜力的许多问题仍未解决。特别的一个问题是，普通人类群体中明显存在针对重组AAV病毒(rAAV)衣壳的预先存在的中和抗体(Nab)。极大一部分人类群体以前接触过各种AAV血清型，并产生了与血流中存在的rAAV结合的中和抗体(Boutin et al,Human Gene Therapy 2010)。由这些抗体结合的病毒通常被中和并且不能将其治疗基因递送到其靶细胞。中和因子的存在率主要取决于所用AAV的血清型及其整体感染性；感染性更强的AAV衣壳通常具有更高的存在率。目前用于临床试验的大多数AAV血清型和变体在人类群体中具有中至高的中和因子存在率，且因此必须采用严格的筛选工艺来过滤出不具有针对所用衣壳的已有抗体的患者。因此，很大一部分需要基于AAV疗法的患者由于存在nAb而无法接受可能挽救生命的治疗。因此，需要能够有效感染肝细胞并且与已有的中和抗体具有最小结合的rAAV载体，以扩大能够接受基于AAV的肝病疗法的患者群体。
[0010]本专利技术通过提供突变的AAV5衣壳克服了现有AAV载体的所述缺点，增加了对人肝细胞的感染性，同时保留了野生型(wt)AAV5所提供的低血清反应性的优势。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术部分基于对修饰的AAV5衣壳蛋白的开发，该修饰的AAV5衣壳蛋白表现出与人肝细胞的结合和/或被人肝细胞内化增加。同样重要的是，修饰的衣壳蛋白显示出与野生型AAV5衣壳蛋白大致相同或更低的血清反应性水平。修饰的衣壳蛋白可有利地被用于实现蛋白质或功能性核酸在受试者肝脏中的递送和表达。
[0013]因此，本专利技术的一个方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的G257R突变。衣壳蛋白还可以包含选自Q179R、F417L、S705G或其任意组合的突变。
[0014]本专利技术的另一个方面涉及修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的突变P200S、M469I和A579T。
[0015]本专利技术的另一个方面涉及编码本专利技术的修饰AAV5衣壳蛋白的核酸和包含该核酸的载体、细胞或病毒颗粒。
[0016]本专利技术的另一个方面涉及AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和本专利技术的修饰的AAV5衣壳蛋白，其中该AAV衣壳包裹AAV载体基因组。
[0017]本专利技术的另一个方面涉及产生包含AAV衣壳的重组AAV颗粒的方法，该方法包括在向体外细胞提供根据本专利技术的核酸、AAV rep编码序列、包含异源核酸的AAV载体基因组和用于产生有效的AAV感染的辅助功能元件；并允许包含AAV衣壳和包裹AAV载体基因组的重组AAV颗粒组装。
[0018]本专利技术的另一个方面涉及药物制剂，其在药学上可接受的载体中包含本专利技术的修饰的AAV5衣壳蛋白、核酸、病毒颗粒或AAV颗粒。
[0019]本专利技术的另一个方面涉及将目的核酸递送至肝细胞的方法，该方法包括使细胞与本专利技术的AAV颗粒接触。
[0020]本专利技术的另一方面涉及将目的核酸递送至哺乳动物受试者的肝细胞的方法，该方法包括向哺乳动物受试者施用有效量的本专利技术的AAV颗粒或药物制剂。
[0021]本专利技术的另一方面涉及治疗需要其的哺乳动物受试者的病症的方法，其中该病症可通过在受试者的肝脏中表达一种产物来治疗，该方法包括向哺乳动物受试者施用治疗有效量的本专利技术的AAV颗粒或药物制剂。
[0022]将在下面的专利技术描述中更详细阐述本专利技术的这些方面和其他方面。
[0023]附图简要说明
[0024]图1描述了使用易错PCR和交错延伸方案随机突变AAV5并生成AAV5突变体库。
[0025]图2描述了在Huh7细胞上筛选AAV5突变体库以获得具有增强的肝嗜性的变体。
[0026]图3描述了在Huh7细胞上进行的第五轮和第七轮选择中携带Loop1R突变的测序变体的百分比。
[0027]图4描述了野生型AAV5的编码VP1的核苷酸序列和在人肝细胞转导时具有最显著增加的AAV5突变体的编码VP1的核苷酸序列(SEQ ID NO:11、1、3、5、7、9)的比对。与野生型AAV5和其他突变体序列相比，白色字体的黑色突出部分指示核苷酸序列的变化。
[0028]图5描述了野生型AAV5的编码VP1的氨基酸序列和在人肝细胞转导时具有最显著增加的AAV5突变体的编码VP1的氨基酸序列(SEQ ID NOS:12、2、4、6、8、10)的比对。与野生型AAV5和其他突变体序列相比，白色字体的黑色高亮部分指示氨基酸序列的变化。
[0029]图6描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后，Huh7细胞中
绿色荧光蛋白(GFP)表达的比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI感染Huh7细胞。使用荧光显微镜在感染后72小时拍摄图像。
[0030]图7A
‑
图7B描述了被包装有GFP报告基因的野生型AAV5或AAV5突变体感染后Huh7细胞中GFP表达的定量比较。用1x105个载体基因组/细胞的MOI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种修饰的腺相关病毒5(AAV5)衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的G257R突变。2.根据权利要求1所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其还包含选自Q179R、F417L、S705G或其任意组合的突变。3.一种修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含相对于野生型AAV5衣壳蛋白(SEQ ID NO:12)的突变P200S、M469I和A579T。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少95％相同的氨基酸序列。5.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少99％相同的氨基酸序列。6.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个至少99.5％相同的氨基酸序列。7.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO:2、4、6、8或10中任一个的氨基酸序列。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白，其共价连接、结合或包裹选自由以下组成的组的化合物：DNA分子、RNA分子、多肽、碳水化合物、脂质和有机小分子。9.一种编码权利要求1
‑
8中任一项所述的修饰的AAV5衣壳蛋白的核酸。10.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。11.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。12.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少99％相同的核苷酸序列。13.根据权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列至少99.5％相同的核苷酸序列。14.根据权利要求9所述的核酸，其包含SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列。15.一种载体，其包含权利要求9
‑
14中任一项所述的核酸。16.根据权利要求15所述的载体，其为质粒、噬菌体、病毒载体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。17.根据权利要求16所述的载体，其中所述病毒载体是AAV载体。18.根据权利要求17所述的载体，其中所述核酸还包含AAV rep编码序列。19.一种体外细胞，其包含权利要求9
‑
14中任一项所述的核酸或权利要求15
‑
18中任一项所述的载体。20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述核酸被稳定整合到所述细胞的基因组中。21.一种病毒颗粒，其包含权利要求9
‑
14中任一项所述的核酸。22.根据权利要求21所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是AAV颗粒、腺病毒颗粒、疱疹病毒颗粒或杆状病毒颗粒。23.一种AAV颗粒，其包含：
AAV载体基因组；和根据权利要求1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖啸，R，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校，
类型：发明
国别省市：