调控的基因编辑系统技术方案

本发明专利技术提供了一种具有降低的脱靶效应的基因编辑系统，包括(a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体，其中编码核酸酶的核酸在其序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中第一内含子和第二内含子从mRNA信息中被剪接以产生编码无功能核酸酶的mRNA，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和(b)结合调控序列的寡核苷酸。还提供了使用本发明专利技术的基因编辑系统调控转基因表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】调控的基因编辑系统优先权声明本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年10月9日提交的美国临时申请第62/743,317号和于2019年7月3日提交的美国临时申请第62/870,427号的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。有关序列表的电子递交的声明根据37C.F.R.§1.821提交了ASCII文本格式的序列表，命名为5470-858WO_ST25.txt，大小为371,885字节，于2019年10月8日生成并通过EFS-Web递交，代替纸质副本。特此将该序列表以引用的方式并入本文的说明书中作为其公开内容。
本专利技术涉及用于调控基因编辑的组合物及其使用方法。专利技术背景基因组测序技术和分析方法的最新进展已经显著加速了对与多种生物学功能和疾病有关的遗传因子进行分类和映射作图的能力。精确靶向基因组的能力将通过允许个别遗传元件的选择性改变来允许因果遗传变异的反向工程化，并促进合成生物学、生物技术和医学应用。尽管已经在基因组编辑技术方面取得了进展，但是已经发现，在基因编辑期间可能发生大量脱靶(例如，意外的突变)，这限制了该方法作为治疗方案。因此，需要一种针对其靶标具有更高的特异性和可靠性的更精确的基因组编辑系统。内源基因表达在几个转录后水平上被进一步调控，这些水平可能是探索外源基因表达的更精确控制的领域。例如，RNA的产生受转录速率控制，但功能性RNA需要正确剪接，然后才能产生正确的基因产物。通过调控转基因RNA的剪接，可以控制基因产物的产生。本专利技术提供了用于在细胞中精确控制基因组编辑系统的表达的组合物和方法，从而降低了脱靶效应并增加其特异性。
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有你想要改变的基因序列(例如，靶基因序列)的细胞中导入：a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体(例如，病毒或非病毒载体、rAAV等)，其中编码核酸酶的核酸在其编码序列内包含调控核酸序列，该调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中当第一内含子和第二内含子从前体mRNA信息中被剪接时，产生编码无功能核酸酶的mRNA，该无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和b)结合所述调控序列的寡核苷酸，其中在细胞内，所述寡核苷酸阻止第二组剪接元件从mRNA被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对靶基因的基因编辑起作用的核酸酶的mRNA。在一个实施方案中，该系统还包含能够结合靶基因序列的gRNA。在此方面的一个实施方案中，核酸酶是CRISPR相关的核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物核酸酶。在此方面的一个实施方案中，核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。可以使用本文所述的系统和方法调控任何基因。例如，在一个实施方案中，待调控的基因是选自由以下组成的组的疾病或病症的疾病相关基因：肌萎缩性侧索硬化症；内毒素血症；动脉粥样硬化性血管疾病，即冠状动脉疾病；支架再狭窄；颈动脉代谢性疾病；中风；急性心肌梗死；心力衰竭；外周动脉疾病；肢体缺血；静脉移植失败；AV内瘘失败(AVfistulafailure)；克罗恩病；溃疡性结肠炎；回肠炎和肠炎；阴道炎；银屑病和炎症性皮肤病如皮炎；湿疹；特应性皮炎；过敏性接触性皮炎；荨麻疹；血管炎；脊柱关节病(spondyloarthropathies)；硬皮病；呼吸道过敏性疾病如哮喘；过敏性鼻炎；超敏性肺病；关节炎(例如，类风湿性关节炎和银屑病性关节炎)；湿疹；牛皮癣；骨关节炎；多发性硬化；系统性红斑狼疮；糖尿病；肾小球肾炎；移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)或工程化组织的排斥；传染病；肌炎；炎性CNS病症；中风；闭合性脑损伤(closed-headinjuries)；神经退行性疾病；阿尔茨海默病；脑炎；脑膜炎；骨质疏松；痛风；肝炎；肝静脉闭塞病(VOD)；出血性膀胱炎；肾炎；脓毒症；结节病；结膜炎；耳炎；慢性阻塞性肺病；鼻窦炎；贝赫切特综合征；移植物抗肿瘤效应；粘膜炎；阑尾炎；阑尾破裂；腹膜炎；主动脉瓣疾病；二尖瓣疾病；雷特综合征；结节性硬化症；苯丙酮尿症；斯-李-奥(Smith-Lemli-Opitz)综合征和脆性X综合征；帕金森病；Aicardi-Goutières综合征；亚历山大病；Allan-Hemdon-Dudley综合征；POLG相关病症；α-甘露糖苷贮积症(II型和III型)；综合征；天使人综合征；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样脂褐质沉积症；β地中海贫血；双侧视神经萎缩和(婴儿)视神经萎缩1型；视网膜母细胞瘤(双侧)；卡纳万病(CanavanDisease)；脑-眼-面-骨骼综合征1[COFS1]；脑腱性黄瘤症；德朗热综合征(CorneliadeLangeSyndrome)；MAPT相关病症；遗传性朊病毒病；Dravet综合征；早发性家族性阿尔茨海默病；弗里德赖希共济失调[FRDA]；弗莱斯综合征；岩藻糖苷贮积症；福山型先天性肌营养不良症；半乳糖唾液酸贮积症；高歇氏病；有机酸血症；噬血细胞性淋巴组织细胞增多症；早年衰老综合症(Hutchinson-GilfordProgeriaSyndrome)；粘多糖症II；婴幼儿游离唾液酸贮积病(InfantileFreeSialicAcidStorageDisease)；PLA2G6相关神经退行性病变；珍维-兰格-尼尔逊(Jervell-Lange-Nielsen)综合征；交界性大疱性表皮松解症(JunctionalEpidermolysisBullosa)；亨廷顿病；克拉伯病(婴幼儿型)；线粒体DNA相关的雷氏综合征(Leighsyndrome)和NARP；Lesch-Nyhan综合征；LIS1相关性无脑回畸形；勒韦(Lowe)综合征；枫糖尿症；MECP2重复综合征；ATP7A相关的铜转运障碍；LAMA2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶A缺乏症；粘多糖病I型、II型或III型；过氧化物酶体生物发生障碍(PeroxisomeBiogenesisDisorder)；泽尔韦格综合征谱；神经退行性疾病伴脑铁沉积症；酸性鞘磷脂酶缺乏症；尼曼匹克症C型；甘氨酸脑病；ARX相关病症；尿素循环障碍；COL1A1/2相关的成骨不全症；线粒体DNA缺失综合征；PLP1相关病症；佩里综合征；Phelan-McDermid综合征；糖原贮积病II型(庞贝病)(婴幼儿型)；MAPT相关病症；MECP2相关病症；肢根斑点状软骨发育不良1型；罗伯特综合征；山德霍夫(Sandhoff)病；Schindler病1型；腺苷脱氨酶缺乏症；斯-李-奥综合征；脊髓性肌萎缩；婴幼儿发作性脊髓小脑性共济失调；氨基己糖苷酶A缺乏症；致死性发育不良1型；VI型胶原相关病症；Usher综合征I型；先天性肌营养不良症；Wolf-Hirschhorn综合征；溶酶体酸性脂肪酶缺乏症；和着色性干皮病。在一个实施方案中，被调控的基因是与周围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有靶基因序列的细胞中导入：/na)包含编码核酸酶的核酸序列的载体，其中编码所述核酸酶的所述核酸在其序列内包含调控核酸序列，所述调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中所述第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中所述第一内含子和第二内含子从前体mRNA信息中被剪接以产生编码无功能核酸酶的mRNA，所述无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和/nb)结合所述调控核酸序列的寡核苷酸，/n其中在所述细胞内，所述寡核苷酸阻止所述第二组剪接元件从所述mRNA被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对靶基因的基因编辑起作用的核酸酶的mRNA。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181009 US 62/743,317;20190703 US 62/870,4271.一种具有降低的脱靶效应的用于编辑基因(例如，改变至少一种基因产物的表达)的系统，包括向具有靶基因序列的细胞中导入：
a)包含编码核酸酶的核酸序列的载体，其中编码所述核酸酶的所述核酸在其序列内包含调控核酸序列，所述调控核酸序列具有定义第一内含子和第二内含子的第一组剪接元件和第二组剪接元件，其中所述第一内含子和第二内含子在编码包含符合读框的终止密码子序列的非天然存在的外显子序列的序列的侧翼，并且其中所述第一内含子和第二内含子从前体mRNA信息中被剪接以产生编码无功能核酸酶的mRNA，所述无功能核酸酶包含由非天然存在的外显子编码的氨基酸序列；和
b)结合所述调控核酸序列的寡核苷酸，
其中在所述细胞内，所述寡核苷酸阻止所述第二组剪接元件从所述mRNA被剪接，从而产生缺少所述外显子并编码对靶基因的基因编辑起作用的核酸酶的mRNA。


2.根据权利要求1所述的系统，其中所述核酸酶选自由以下组成的组：CRISPR相关的核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶。


3.根据权利要求1所述的系统，其中所述核酸酶是核酸内切酶或核酸外切酶。


4.根据权利要求1所述的系统，其中组分(a)还包含结合所述靶基因序列的gRNA。


5.根据权利要求1所述的系统，其中所述调控核酸序列是β珠蛋白突变型内含子。


6.根据权利要求1所述的系统，其包含至少两种调控核酸序列。


7.根据权利要求1所述的系统，其中所述调控核酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQIDNO:18(IVS2-654内含子C-T)、SEQIDNO:50(具有564CT突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:51(具有657G突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:52(具有658T突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:20(具有657GT突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:53(具有200bp缺失的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:68(仅具有197bp的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:55(具有6A突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:56(具有564C突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:57(具有841A突变的IVS2-654内含子)、SEQIDNO:59(具有564CT突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:60(具有657G突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:61(具有658T突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:62(具有657GT突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:63(具有200bp缺失的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:64(具有425bp缺失的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:65(具有6A突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:66(具有564C突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:67(具有841A突变的IVS2-705内含子)、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:143、SEQIDNO:144、SEQIDNO:145、SEQIDNO:146、SEQIDNO:147、SEQIDNO:148，及其任何组合，包括单个序列。


8.根据权利要求1所述的系统，其中结合所述调控序列的所述寡核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQIDNO:37(针对IVS2-654CT的寡核苷酸)、SEQIDNO:38(针对具有657GT突变的IVS2-654的寡核苷酸)、SEQIDNO:39(针对IVS2-654中6A突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:40(针对IVS2-654中564C突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:41(针对IVS2-654中564CT突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:43(针对IVS2-654中841A突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:44(针对IVS2-654中657G突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:45(针对IVS2-654中658T突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:42(针对IVS2-705中705G突变的寡核苷酸)、SEQIDNO:49(针对IVS2-705的寡核苷酸)、SEQIDNO:76(诱导反义外显子23跳跃的寡核苷酸)以及SEQIDNO138(针对LUC-AON1的寡核苷酸)、SEQIDNO:139(针对LUC-AON2的寡核苷酸)、SEQIDNO:140(针对LUC-AON3的寡核苷酸)、SEQIDNO:141(针对LUC-AON4的寡核苷酸)、SEQIDNO:142(针对IVS2(S0)-654,LUC-65...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查·J·萨谬斯基，
申请(专利权)人：北卡罗来纳大学查佩尔希尔分校，
类型：发明
国别省市：美国;US