T-ALL来源诱导多能干细胞模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种T‑ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：a、将携带KOS、c‑Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T‑ALL生物体的外周血单个核细胞中；b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。本发明专利技术还公开了一种诱导多能干细胞。

【技术实现步骤摘要】
T-ALL来源诱导多能干细胞模型及其构建方法
本专利技术涉及T-ALL研究模型
，特别是涉及诱导多能干细胞及其构建方法。
技术介绍
急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，由造血干细胞的异常增殖和分化引起。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是由T细胞前体的基因改变引起的，导致胸腺、血液、骨髓和外周组织中T细胞的发育停滞和聚集。多年来，转录因子表达失调、CDKN2A/2B细胞周期调节因子的损伤和NOTCH1信号的过度激活在T-ALL的发病机制中起着重要作用。尽管T-ALL的诊断和治疗已经取得了很大的进展，但耐药、复发等难治性T-ALL的治疗仍然是临床亟待解决的问题，因此构建合适的T-ALL研究模型对于T-ALL的临床研究具有重要的作用。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞及其构建方法，提供T-ALL的研究模型。一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。在其中一些实施例中，所述病毒载体选自仙台病毒。在其中一些实施例中，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。在其中一些实施例中，所述造血干细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。在其中一些实施例中，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～120ng/mL、IL-3为15ng/mL～25ng/mL，IL-6为8ng/mL～12ng/mL。在其中一些实施例中，步骤b包括：将步骤a得到的转染后的细胞先在无层粘连蛋白的培养板中培养66小时～78小时；经离心、复悬之后，转移入包被层粘连蛋白的培养板上进行培养。在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在缺乏细胞因子的培养基中进行培养。在其中一些实施例中，所述在包被层粘连蛋白的培养板上进行培养包括在SCF≤60ng/mL，FLT3LG≤60ng/mL、IL-3为12.5ng/mL，IL-6为6ng/mL的无血清培养基中进行培养。在其中一些实施例中，步骤b包括：在包被层粘连蛋白的培养板上培养20小时～28小时后，在胚胎干细胞培养基中进行培养。所述的诱导多能干细胞的制备方法制备得到的诱导多能干细胞。本专利技术对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。附图说明图1为本专利技术一实施例的PBMC细胞重编程为iPSC过程的显微拍摄图(40×)；图2为本专利技术一实施例的iPSC克隆传代10次后的显微拍摄图(40×)；图3为本专利技术一实施例的iPSC克隆的碱性磷酸酶染色结果(40×)；图4为本专利技术一实施例的iPSC四种多能性标志蛋白的免疫荧光染色图；图5为本专利技术一实施例的畸胎瘤的三胚层HE染色图；图6为本专利技术一实施例的Notch1突变的基因组测序图，其中，H-iPS为健康人PBMC来源的iPS细胞，W10-iPS为T-ALL来源的iPS细胞；图7为本专利技术一实施例的LY411575药物处理W10-iPS的IC50曲线图；图8为本专利技术一实施例的非耐药W10-iPS与耐药W10-R的耐药性流式检测图；图9为本专利技术一实施例的非耐药iPS和耐药iPS生信分析结果图；图10为本专利技术一实施例的6种基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；图11为本专利技术一实施例的MAEL基因敲降W10-R的耐药性流式检测图；图12为本专利技术一实施例的各组细胞内MAEL、MRP、LRP基因的相对表达量统计图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本专利技术实施例提供一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。本专利技术对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)体细胞进行重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs)。结果表明T-ALL来源iPSCs具有与T-ALL相同的突变，可作为T-ALL疾病研究模型。与传统的肿瘤模型相比，通过本实施例构建的T-ALL来源的iPSC模型具有以下优点：(1)可用于T-ALL进展的早期研究；(2)原代T-ALL来源的iPSC可再次分化为T-ALL细胞。对这一过程进行基因筛选和表观遗传学分析，有助于识别与T-ALL发生、发展相关的原癌基因突变和表观遗传学修饰；(3)由于肿瘤是一个异质性细胞群，每个iPS克隆来自单个肿瘤细胞，因此，对每个iPS克隆进行单独研究，可以全面挖掘肿瘤发生、发展的机制肿瘤发病机制复杂；(4)T-ALL来源的iPSCs能长期维持自我更新和增殖，是高通量筛选治疗药物和毒性研究的理想平台；(5)来源于T-ALL细胞的iPSCs是一种个体化的T-ALL肿瘤模型；(6)T-ALL来源的耐药iPSCs可作为T-ALL耐药研究模型，用于进一步研究T-ALL的耐药机制并开发相应药物。因此，与传统的肿瘤模型相比，iPSC模型能够更准确地揭示肿瘤发病机制和耐药机制，开发有效的肿瘤治疗方法。诱导多能干细胞可通过在体细胞导入核程序重编因子的基因来制备。核程序重编因子可选自OCT4、SOX2、c-Myc、Klf4、NANOG、LIN28、KOS中的组合。但是，并非所有导入了这些基因的体细胞会被诱导成iPS细胞，事实上，只有其中一部分会被诱导成iPS细胞。其中在本专利技术实施例中，T-ALL来源的体细胞制备诱导多能干细胞使用的核程序重编因子选自KOS、c-Myc和Klf4的组合。用于形成诱导多能干细胞的体细胞的种类，例如，可使用诸如成纤维细胞、前体脂肪细胞、肝细胞、血细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：/na、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；/nb、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种T-ALL来源诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
a、将携带KOS、c-Myc和Klf4基因的病毒载体按照MOI比值为(4.5～5.5)：(4.5～5.5)：(2.5～3.5)的量转染入源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞中；
b、将步骤a得到的转染后的细胞进行培养。


2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述病毒载体选自仙台病毒。


3.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，步骤a中，转染之前，包括将源自T-ALL生物体的外周血单个核细胞悬浮在造血干细胞无血清培养基中，接种于培养板上，培养66小时～78小时的步骤。


4.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述造血干细胞无血清培养基含有L-谷氨酰胺、SCF、FLT3LG、IL-3和IL-6。


5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，在所述造血干细胞无血清培养基中，L-谷氨酰胺的质量百分数为0.8％～1.2％，SCF为80ng/mL～120ng/mL，FLT3LG为80ng/mL～...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘韬，陈雪梅，
申请(专利权)人：深圳市罗湖区人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44