一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用制造技术

本发明专利技术提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点。结果表明，免疫重组病毒rPIV5‑SH‑Spike组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明rPIV5‑SH‑Spike重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种表达新冠病毒Spike蛋白重组副流感病毒5型制备和应用。
技术介绍
新冠肺炎的临床症状包括发热、干咳、乏力等，患者可出现鼻塞、流涕、咽痛、结膜炎等多种症状，重症患者可出现呼吸困难、低氧血症，严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克等甚至导致死亡。疫苗接种是预防新冠病毒的最有效手段之一，目前各国已有多个研究机构进行新冠疫苗的制备，包括灭活疫苗，重组蛋白疫苗，重组腺病毒疫苗，mRNA疫苗以及病毒载体疫苗等。灭活疫苗可以有效地激发高水平的体液免疫，相对安全，但不能诱导细胞毒T淋巴细胞反应，不能够产生局部免疫反应；重组蛋白疫苗技术成熟，不良反应小，但生产速度较慢；重组腺病毒疫苗虽然免疫效果好，但可能会存在一定的不良反应，且人体内可能含有针对腺病毒载体的抗体，会影响疫苗效果；mRNA疫苗相对效果好，但存储运输条件相对较为苛刻，成本较高。病毒载体疫苗具有多种优势，由于是活病毒载体，可在免疫机体内进行复制，诱导较强的免疫反应；可通过自然感染，如滴鼻、喷雾等方式进行免疫；可产生体液免疫与细胞免疫，除了激发全身免疫反应外，还可激发局部免疫反应，如在呼吸道中产生sIgA抗体，发挥较强的免疫保护效果。目前，在新冠疫苗的研发过程中，已有多种病毒载体疫苗在研发过程中，并在动物模型中具有良好的免疫保护效果，如黄热病毒、痘病毒、新城疫病毒、水疱口炎病毒等。副流感病毒5型(PIV5)作为预防犬窝咳的疫苗在犬中应用已有数十年的历史，而且未被证实可引起任何其他动物包括人致病。
技术实现思路
本专利技术提供一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)。可选的，所述冠状病毒为2019-nCoV。可选的，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因核苷酸序列，所得；所述序列甲为如下1)或2)或3)：A)SEQIDNO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：2的第682位-685位的氨基酸ArgArgAlaArg(RRAR)替换为Ala(A)，其他序列保持不变，所得序列。一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的方法，该方法包括使该细胞与上述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体相接触。一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体的制备方法，包括如下步骤：1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒pPIV5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；所述序列甲为如下1)或2)或3)：A)SEQIDNO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点(RRAR)，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点RRAR，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。可选的，步骤1)中所述克隆载体为带有T7RNA聚合酶启动子序列、带有丁肝核酶序列、T7RNA聚合酶转录终止序列的克隆载体。一种新型冠状病毒(2019-nCoV)疫苗的制备方法，所述疫苗的制备方法包括如下步骤：将上述表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体、表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L共转染宿主细胞；所述表达辅助蛋白的辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L是将副流感病毒5型的NP、P和L蛋白的编码基因分别插入哺乳动物表达载体中，得到辅助重组质粒—NP、辅助重组质粒—P和辅助重组质粒—L。可选的，NP蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；P蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；L蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示。可选的，所述宿主细胞为BSR-T7细胞，MDBK细胞,Vero细胞或BHK-21细胞。上述方法制备得到的疫苗。上述重组副流感病毒5型载体或上述方法制备的重组副流感病毒5型载体在如下任一一种中的应用：(1)制备提高动物体内针对冠状病毒2019-nCoVSpike蛋白抗体水平的产品中的应用；(2)制备预防或辅助预防冠状病毒2019-nCoV引起的疾病产品中的应用。步骤3)中哺乳动物表达载体为pcDNA3.1(+)。本专利技术技术方案，具有如下优点：结果表明，免疫重组病毒rPIV5-SH-Spike组小鼠体内产生抗体针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体，而rPIV5对照组小鼠未能检测到针对新冠病毒Spike蛋白的特异性抗体。表明rPIV5-SH-Spike重组病毒免疫小鼠能够刺激小鼠产生针对Spike蛋白的特异性抗体。首免后6周，每只小鼠滴鼻感染新冠病毒SARS-CoV-2，接种剂量104，之后每天观察小鼠的临床症状，并在攻毒后第3天，每组各剖检5只小鼠，采集小鼠肺脏，研磨组织，取上清液提取RNA后利用实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒在小鼠脏器中的复制水平。试验结果见图5，结果表明，免疫rPIV5-SH-Spike的小鼠肺脏病毒滴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述重组副流感病毒5型载体包含一种副流感病毒5型基因组，所述基因组包含冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列；所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列，且冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点。


2.根据权利要求1所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述冠状病毒为2019-nCoV。


3.根据权利要求1或2所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体，其特征在于，所述副流感病毒5型基因组为：用序列甲替换一种副流感病毒5型基因组的小疏水蛋白基因序列，所得；
所述序列甲为如下1)或2)或3)：
A)SEQIDNO：1所示核苷酸序列第927位核苷酸由A突变为G、第3216位核苷酸由A突变为G、第2106位核苷酸由A突变为G，且第2044位至2055位替换为GCA，得到的DNA分子；
B)在严格条件下与A)限定的DNA分子杂交且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列；
C)与A)或B)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述冠状病毒Spike蛋白突变体的DNA序列，冠状病毒Spike蛋白突变体的氨基酸序列上不含有Furin蛋白酶裂解位点，所述冠状病毒Spike蛋白突变体的编码序列不含有副黏病毒转录终止序列。


4.一种在细胞中表达冠状病毒Spike蛋白的方法，其特征在于，该方法包括使该细胞与如权利要求1至3中任一项所述的表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体相接触。


5.一种表达冠状病毒Spike蛋白的重组副流感病毒5型载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将副流感病毒5型全基因组反转录得到的cDNA插入克隆载体中，得到重组质粒pPIV5；
2)用序列甲替换步骤1)中重组质粒pPIV5中副流感病毒5型的小疏水蛋白基因核苷酸序列；
所述序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金华，孙洪磊，孙浩然，李涵，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11