【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺病毒表达载体及生产方法和细胞系
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月7日提交的美国临时申请号63/006,266的优先权,该申请的全部内容并入本文。
[0003]本申请一般的涉及腺病毒载体和基因治疗,更具体地说,涉及不可复制的腺病毒表达载体、合成方法和复制方式。
技术介绍
[0004]腺病毒载体的核苷酸序列通常有许多千碱基长,这使得体外操作不那么方便,也难以实现。对腺病毒载体的操作,如果操作不当,也会导致载体的无节制复制。此外,用于生产腺病毒的普通哺乳动物细胞系往往拥有腺病毒基因的内源拷贝,它们可以与突变的腺病毒载体重组,产生具有感染性的复制病毒。因此,存在对安全的、非感染性的、重组的、不可复制的、具有有效表达盒的腺病毒载体的需求,用于治疗用途。还希望提供一种在细菌中更有效地生产这些重组载体的方案,克服操作大型腺病毒序列的困难。最后,进一步希望能提供一种用于复制工程化的腺病毒载体的哺乳动物细胞系,以消除能复制的腺病毒可能带来的污染。
技术实现思路
[0005]本公开提供了一种腺病毒载体,它具有:a)使其不能复制的一种或多种突变,和b)携带核苷酸表达盒,当转导到宿主细胞时允许表达治疗剂。本文公开了工程化的腺病毒载体的序列。本文还提供了在细菌中更有效地生产合成的腺病毒载体的方案和方法。最后,本文产生了用于复制工程化的腺病毒载体的工程化的哺乳动物细胞系,以消除能复制的腺病毒的可能污染。
[0006]不可复制的腺病毒表达载体可以包括:a)使腺病毒不能复 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种不可复制的腺病毒表达载体,其包括:a)使腺病毒不能复制的一种或多种突变,和b)编码基因产物的至少一个核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的载体,其中所述载体包括在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的整个序列上具有至少80%序列同一性的核苷酸序列,或其互补序列。3.根据权利要求2所述的载体,其中所述载体包括与SEQ ID NO:1
‑
2具有至少约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或大于99%序列同一性的核酸序列。4.根据权利要求1所述的载体,其中所述载体包括腺病毒血清型5载体。5.根据权利要求1所述的载体,其中所述一种或多种突变包括E1基因或E3基因或两者的缺失。6.根据权利要求1所述的载体,其中所述至少一个核苷酸序列包括转基因。7.根据权利要求6所述的载体,其中所述转基因表达人IL10。8.根据权利要求6所述的载体,其中所述转基因进一步包括包含CAG区域的增强子/启动子区域、人IL10cDNA、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。9.根据权利要求8所述的载体,其中所述多腺苷酸化信号包括SV40区域和/或完整polyA信号。10.根据权利要求8所述的载体,其中所述多腺苷酸化信号首先插入SEQ ID NO:3的核苷酸440和3515之间。11.根据权利要求8所述的载体,其中转基因的插入取代了E1基因,但使pIX基因保持完整。12.一种合成腺病毒载体的方法,其包括:a)产生多个重叠的腺病毒子片段,每个子片段包括腺病毒全基因组的一部分;b)将子片段环化以形成质粒结构;和c)将环化的子片段组装成线性结构,其中所述载体包括两个或更多个子片段的组合。13.根据权利要求12所述的方法,其中所述腺病毒载体包括腺病毒血清型5。14.根据权利要求13所述的方法,其中所述载体在细菌中的复制效率高。15.根据权利要求12所述的方法,其中第一子片段包括从SEQ ID NO:4的3
’
端或从SEQ ID NO:5的5
’
端所述的序列。16.根据权利要求12所述的方法,其中第二子片段包括从SEQ ID NO:6的3
’
端或SEQ ID NO:7中的5
’
端所述的序列。17.根据权利要求12所述的方法,其中第二子片段的右端由SEQ ID NO:11编码。18.根据权利要求12所述的方法,其中第二子片段的左端由SEQ ID NO:12编码。19.根据权利要求12所述的方法,其中第二子片段的3
′
端由SEQ ID NO:13编码。20.权利要求12所述的方法,其中每个子片段包括约50%的腺病毒全基因组。21.根据权利要求20所述的方法,其中至少一个片段包括表达人IL
‑
10的转基因。22.根据权利要求21所述的方法,其中所述转基因进一步包括增强子或启动子区域、人IL10 cDNA基因、或多腺苷酸化信号、或其任意组合中的至少一个。23.根据权利要求22所述的方法,其中所述增强子/启动子区域包括CAG启动子。24.根据权利要求22所述的方法,其中所述转基因至少包...
【专利技术属性】
技术研发人员:C,
申请(专利权)人:朗格生物技术公共公益股份有限公司,
类型:发明
国别省市:
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