腺病毒的大负载整合制造技术

本公开提供了可容纳或含有大转位子负载、例如多达40kb的转位子负载的重组腺病毒载体和腺病毒基因组。所述腺病毒载体和基因组可递送所述大转位子负载到目标基因组中，例如用于基因疗法。基因疗法。基因疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】腺病毒的大负载整合
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月13日提交的美国临时申请第63/009,298号的在先提交日的优先权和益处，该临时申请以全文引用的方式并入本文中。
[0003]关于联邦政府资助研究或开发的陈述
[0004]本专利技术是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的授权号HL128288和HL136135下进行。在本专利技术中政府具有某些权利。


[0005]本公开尤其提供了可容纳或含有大转位子负载、例如多达40kb的转位子负载的重组腺病毒载体和腺病毒基因组。腺病毒载体和基因组中的某些可递送大转位子负载到目标基因组中，例如用于基因疗法。

技术介绍

[0006]基因疗法呈现许多挑战。病毒载体是基因疗法的一种手段。在一些情况下，用于基因疗法的病毒载体在研发中的各种挑战包括载体负载容量、转基因整合到目标细胞基因组中的效率、转基因表达的细胞类型特异性、转基因表达量和整合的位置效应。使用病毒载体的基因疗法的各种方法需要消耗资源的步骤——从受试者取出细胞和在向受试者投与细胞之前离体工程化和/或扩增细胞。至少出于这些原因，且尤其鉴于利用病毒载体的疗法的数目的增长，极需要改良的病毒载体设计。
[0007]血红蛋白病是全世界最普遍的遗传病症之一，值得注意地，不发达国家中出生的患者的生存率显著降低。血红蛋白病的实例包括镰状细胞病和地中海贫血。患者特异性血液干细胞/祖细胞(HSPC)基因疗法具有治疗血红蛋白病的极大潜力。
[0008]此外，世界卫生组织已经识别了超过80种原发性免疫缺陷疾病。这些疾病的特征在于免疫系统中的内在缺陷，其中在一些状况下，身体不能产生任何或足够的抵抗感染的抗体。在其它状况下，对抗感染的细胞防御不能恰当地工作。通常，原发性免疫缺陷是遗传性病症。
[0009]继发性或获得性免疫缺陷并不是遗传基因异常的结果，而是在免疫系统因免疫系统以外的因素而受损的个体中发生。实例包括创伤、病毒、化学疗法、毒素和污染。获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的继发性免疫缺陷病症的实例，其中T淋巴细胞耗竭使得身体无法对抗感染。
[0010]X连锁严重联合免疫缺陷症(SCID
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X1)是由共同的γ链基因(γC)的突变引起的细胞和体液免疫耗竭，其导致T和自然杀伤(NK)淋巴细胞的缺乏和非功能性B淋巴细胞的存在。SCID
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X1在生命前两年是致命的，除非免疫系统例如通过骨髓移植(BMT)或基因疗法复原。
[0011]因为大部分个体缺乏BMT或非自体基因疗法的匹配供体，所以通常使用成熟T细胞耗竭的单倍体相合亲本骨髓；然而，并发症包括移植物抗宿主疾病(GVHD)；无法产生足够抗
体，因此需要长期进行免疫球蛋白置换；由于不能植入造血干细胞和祖细胞(HSPC)而造成T细胞后期损失；慢性疣；和淋巴细胞失调。
[0012]范可尼贫血(Fanconi anemia，FA)是引起骨髓衰竭的遗传性血液病症。其部分特征是DNA修复机制缺陷。至少20％ FA患者出现例如急性骨髓白血病的癌症，和皮肤、肝脏、胃肠道和妇科系统的癌症。皮肤和胃肠道肿瘤通常是鳞状细胞癌。出现癌症的患者的平均年龄为白血病15岁，肝脏肿瘤16岁，和其它肿瘤23岁。
[0013]已经探索使用体内基因疗法进行治疗，其包括向患者直接递送病毒载体。体内基因疗法是简单而有吸引力的方法，因为其可能不需要任何基因毒性调节(或可能需要较少的基因毒性调节)或离体细胞加工，因此可在全世界许多机构，包括发展中国家中的机构采用，因为该疗法可通过注射投与，类似于在全世界已经进行的用于递送疫苗的方法。
[0014]腺病毒由于其基因组尺寸中等、易于操控、高滴度、目标细胞范围宽和高感染性而尤其适用作基因转移载体。病毒基因组的两端含有100至200个碱基对反向重复序列(ITR)，ITR是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域含有不同的转录单元，所述单元由病毒DNA复制起点分隔。E1区域(E1A和E1B)编码负责病毒基因组和少数细胞基因的转录的调控的蛋白质。E2区域(E2A和E2B)的表达引起用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭。晚期基因的产物，包括大部分病毒衣壳蛋白，只在大量加工由主要晚期启动子(MLP)发出的单一初级转录物之后才表达。MLP在感染晚期期间尤其有效，且由所述启动子发出的所有mRNA均具有5'
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三联前导序列(TPL)序列，这使其成为翻译的优选mRNA。
[0015]对于成功的基因疗法，在没有整合的位置效应和转录沉默的情况下，转移基因必须在所需组织或细胞中表达量高。基因座控制区域(LCR)尤其适合于完成这一任务，因为LCR的特征在于其能够在异位染色体位点处以组织特异性和拷贝数依赖性方式增强连接的基因的表达到生理水平。LCR的组分通常共定位到表达细胞的染色质中的DNA水解酶I超敏(HS)位点。个别HS处的核心决定子由多个普遍存在和谱系特异性的转录因子结合位点的阵列构成。

技术实现思路

[0016]本公开尤其包括腺病毒载体和腺病毒基因组、包括两种或更多种本公开的腺病毒载体和/或腺病毒基因组的系统和这类腺病毒载体、腺病毒基因组和系统的用途。在某些实施例中，本专利技术包括包含例如1kb至40kb的转位子负载的腺病毒载体和/或腺病毒基因组。在本公开的某些实施例中，转位酶可引起例如多达40kb的转位子负载整合到目标细胞的基因组中。因此，本公开尤其包括能够将腺病毒供体载体中存在的多达40kb的负载.到目标细胞基因组中的载体、基因组和系统。如所属领域的技术人员将了解，载体在其中和本身整合的容量是基因疗法系统的一个非常重要的特征，这至少部分因为整合容量限制治疗负载的长度和/或复杂性。
[0017]本公开中识别的长和/或复杂核酸负载的某些实例包括包含长基因座控制区域的负载。由于其长度问题，长基因座控制区域在历史上不适合包括于腺病毒负载中，但包括但不限于包含长基因座控制区域的长和/或复杂核酸负载的长和/或复杂核酸负载可根据本文所公开的载体、基因组和系统整合到目标细胞基因组中。
[0018]因此，在一个实施例中，提供一种腺病毒供体载体，其包括：(a)腺病毒衣壳；和(b)线性双股DNA基因组，其包括：(i)至少10kb的转位子负载；(ii)侧接所述转位子负载的转位子反向重复序列(IR)；和(iii)侧接所述转位子反向重复序列的重组酶正向重复序列(DR)。
[0019]另一实施例为一种腺病毒供体基因组，其包括：(a)至少10kb的转位子负载；(b)侧接所述转位子负载的转位子反向重复序列(IR)；和(c)侧接所述转位子反向重复序列的重组酶正向重复序列(DR)。
[0020]还提供了一种腺病毒转位系统，其包括：(a)如本文所述的腺病毒供体载体；和(b)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺病毒供体载体，其包含：(a)腺病毒衣壳；和(b)线性双股DNA基因组，其包含：(i)至少10kb的转位子负载；(ii)侧接所述转位子负载的转位子反向重复序列(IR)；和(iii)侧接所述转位子反向重复序列的重组酶正向重复序列(DR)。2.一种腺病毒供体基因组，其包含：(a)至少10kb的转位子负载；(b)侧接所述转位子负载的转位子反向重复序列(IR)；和(c)侧接所述转位子反向重复序列的重组酶正向重复序列(DR)。3.一种腺病毒转位系统，其包含：(a)根据权利要求1所述的腺病毒供体载体；和(b)腺病毒支撑载体，其包含：(i)腺病毒衣壳；和(ii)腺病毒支撑基因组，其包含编码转位酶的核酸序列。4.一种腺病毒转位系统，其包含：(a)根据权利要求2所述的腺病毒供体基因组；和(b)腺病毒支撑基因组，其包含编码转位酶的核酸序列。5.一种腺病毒产生系统，其包含：(a)包含根据权利要求2所述的腺病毒供体基因组的核酸；和(b)包含腺病毒辅助基因组的核酸，所述腺病毒辅助基因组包含条件性包装元件。6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载包含长LCR，任选地其中所述长LCR为包含β
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球蛋白LCR HS1至HS5的β
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球蛋白长LCR。7.根据权利要求6所述的载体、基因组或系统，其中所述长LCR具有至少27kb的长度。8.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载包含表1中所阐述的LCR。9.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载具有至少15kb、至少16kb、至少17kb、至少18kb、至少19kb、至少20kb、至少21kb、至少22kb、至少23kb、至少24kb、至少25kb、至少30kb、至少35kb、至少38kb或至少40kb的长度。10.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载具有10kb
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35kb、10kb
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30kb、15kb
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35kb、15kb
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30kb、20kb
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35kb或20kb
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30kb的长度。11.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载具有10kb
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32.4kb、15kb
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32.4kb或20kb
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32.4kb的长度。12.根据权利要求1到11中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载包含编码蛋白质的核酸序列，任选地其中所述蛋白质为治疗性蛋白质。13.根据权利要求12所述的载体、基因组或系统，其中所述蛋白质选自由β球蛋白替代蛋白和γ
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球蛋白替代蛋白组成的群组。14.根据权利要求12所述的载体、基因组或系统，其中所述蛋白质为第八因子替代蛋白。
15.根据权利要求12或13所述的载体、基因组或系统，其中编码所述蛋白质的所述核酸序列与启动子可操作地连接，任选地其中所述启动子为β球蛋白启动子。16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子反向重复序列为睡美人(SB)反向重复序列，任选地其中所述SB反向重复序列为pT4反向重复序列。17.根据权利要求3到15中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位酶为睡美人(SB)转位酶，任选地其中所述转位酶为睡美人100x(SB100x)。18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述重组酶正向重复序列为FRT位点。19.根据权利要求3到18中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述腺病毒支撑基因组包含编码重组酶的核酸。20.根据权利要求19所述的载体、基因组或系统，其中所述重组酶为FLP重组酶。21.根据权利要求1到20中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载包含β
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球蛋白长LCR，所述转位子负载包含与β
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球蛋白启动子可操作地连接的编码β
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球蛋白的核酸序列，所述反向重复序列为SB反向重复序列，且所述重组酶正向重复序列为FRT位点。22.根据权利要求1到21中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述转位子负载包含选择盒，任选地其中所述选择盒包含编码mgmt
P140K
的核酸序列。23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的载体、基因组或系统，其中所述腺病毒衣壳被修饰成对CD46的亲和力增加，...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：