一种新型的基于水泡性口炎病毒的CRISPRRNA递送系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种新型的基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统及其应用，所述递送系统具有递送效率高、靶向性强等优点，本发明专利技术提供的基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统可用于靶向递送CRISPR RNA系统进行基因疾病治疗、细菌和病毒感染防治等，具有非常好的临床应用前景。的临床应用前景。的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种新型的基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种CRISPR RNA递送系统，更具体地，本专利技术涉及一种新型的基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统及其应用。

技术介绍

[0002]成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是广泛存在于细菌和古细菌中的一组DNA序列，由重复(Repeats)序列和间隔(Spacer)序列组成。其中，间隔序列与外源性DNA具有同源性，是噬菌体、病毒等侵入性核酸留下的痕迹，在随后的感染中可以检测和破坏类似的DNA。Cas序列位于CRISPR序列的附近，编码与CRISPR功能密切相关的蛋白。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在抵御病毒和质粒的不断入侵中演化来的一种获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas系统有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中CRISPR/Cas作为Ⅱ型的标记基因应用最为广泛，其介导的基因编辑可用于生成转基因模型、调节转录、调控表观遗传等。
[0003]CRISPR/Cas系统作为一种新型基因组编辑技术，能够靶向干扰或修复基因组的特定基因。来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas系统已经由生物学家发现或构建，Cas核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas系统的主要组成成分。该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘，基因功能的鉴定，动物模型的建立以及基因治疗药物的开发。CRISPR/Cas系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症。然而，如何有效递送CRISPR/Cas至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的重要挑战之一，这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力。
[0004]目前，CRISPR/Cas系统的递送方法包括：物理方法、病毒递送系统、非病毒递送系统。其中，物理方法主要用于体外或离体细胞和组织的基因编辑，应用局限；病毒递送系统主要包括采用腺病毒载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体递送CRISPR/Cas系统，其中腺病毒载体存在如下缺点，1、预存免疫：腺病毒在人群中感染较多，因此容易在体内存在抵抗；2、长期存在：该系统递送的为DNA，会在终末细胞中长期存在，且会有随机插入等风险；3、腺相关病毒存在容量小等问题；慢病毒载体和逆转录病毒载体递送系统主要存在插入导致致癌性的风险，即便是非整合型载体，依旧具有潜在的插入可能性；而非病毒递送系统虽不存在病毒载体的安全风险，但其靶向受体递送功能目前还处于早期研究阶段，靶向性较差。
[0005]本领域常用的CRISPR病毒递送系统，对于递送CRISPR RNA系统均具有明显的劣势，因此，如何高效、特异地递送CRISPR RNA系统进入易感细胞仍然是本领域面临的一个重要的技术问题。

技术实现思路

[0006]鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术缺陷，本专利技术提供了一种新型的基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统及其应用，此外，本专利技术提供的递送系统为首个
在本领域应用的RNA递送系统，弥补了本领域的空白；本专利技术经科学的实验验证发现所述基于水泡性口炎病毒的CRISPR RNA递送系统具有递送效率高、靶向性强等优点。
[0007]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0008]本专利技术的第一方面提供了一种核酸分子。
[0009]进一步，所述核酸分子依次包含编码如下可操作性相连元件的核酸序列：sgRNA、N蛋白、P蛋白、M蛋白、目标分子、L蛋白；
[0010]优选地，所述目标分子包括Cas蛋白、CRISPR单碱基编辑器、CRISPR先导编辑器、抗菌肽、抗体；
[0011]更优选地，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13、Cas3、Cas4、Cas1、Cas2、Cas10、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas7
‑
11；
[0012]更优选地，所述CRISPR单碱基编辑器包括CBE、ABE；
[0013]最优选地，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12、Cas13；
[0014]最优选地，所述Cas蛋白为Cas13中的CasRx；
[0015]更优选地，所述抗菌肽包括微生物抗菌肽、动物抗菌肽、人源性抗菌肽、植物抗菌肽；
[0016]最优选地，所述核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0017]在本专利技术的具体实施方案中，包含目标分子和sgRNA的核酸的具体图谱为VSV
‑
NT
‑
pre
‑
sgRNA
‑
CasRx。
[0018]本专利技术的第二方面提供了一种表面表达G蛋白的重组水泡性口炎病毒载体。
[0019]进一步，所述病毒载体包含本专利技术第一方面所述的核酸分子；
[0020]优选地，所述病毒载体由如下可操作性相连元件构成：N蛋白、P蛋白、M蛋白、L蛋白、病毒基因组；
[0021]更优选地，所述病毒载体还包含G蛋白。
[0022]本专利技术中所述的水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)，属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)水泡病毒属(Vesiculovirus)，是有囊膜的单股负链RNA(ssRNA)病毒。VSV基因组的长约11kb。从3
’
端
→5’
端依次排列着N、P、M、G、L共5个不重叠的基因，分别编码核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白、及RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的主要蛋白。N基因的3
’
端有不翻译的先导序列，5
’
端有非翻译区，各基因间有间隔序列。先导RNA在感染细胞中是最早的病毒转录物。
[0023]在本专利技术的具体实施方案中，所述表面表达G蛋白的重组水泡性口炎病毒载体为复制缺陷型的重组水泡性口炎病毒载体(rVSVΔG
‑
sgRNA
‑
Cas
‑
G)，这种复制缺陷型的重组病毒载体仍具有感染靶细胞的能力，但是不发生复制，因而不会直接造成靶细胞的损害。在本专利技术中所述的表面表达G蛋白的重组水泡性口炎病毒载体包括复制缺陷型和复制型，因此，复制缺陷型和复制型的表面表达G蛋白的重组水泡性口炎病毒载体均在本专利技术的保护范围内。
[0024]在本专利技术的具体实施方案中，所述的sgRNA(single guide RNA)为引导RNA，从而引导Cas蛋白对核酸的定点切割。
[0025]本专利技术的第三方面提供了一种重组宿主细胞。
[0026]进一步，所述重组宿主细胞包含本专利技术第一方面所述的核酸分子、和/或本专利技术第
二方面所述的病毒载体；
[0027]优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
[0028本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子依次包含编码如下可操作性相连元件的核酸序列：sgRNA、N蛋白、P蛋白、M蛋白、目标分子、L蛋白；优选地，所述目标分子包括Cas蛋白、CRISPR单碱基编辑器、CRISPR先导编辑器、抗菌肽、抗体；更优选地，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13、Cas3、Cas4、Cas1、Cas2、Cas10、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas7
‑
11；更优选地，所述CRISPR单碱基编辑器包括CBE、ABE；最优选地，所述Cas蛋白为Cas9、Cas12、Cas13；更优选地，所述抗菌肽包括微生物抗菌肽、动物抗菌肽、人源性抗菌肽、植物抗菌肽；最优选地，所述核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.一种表面表达G蛋白的重组水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述重组水泡性口炎病毒载体包含权利要求1所述的核酸分子；优选地，所述病毒载体由如下可操作性相连元件构成：N蛋白、P蛋白、M蛋白、L蛋白、病毒基因组；更优选地，所述病毒载体还包含G蛋白。3.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含权利要求1所述的核酸分子、和/或权利要求2所述的病毒载体；优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、真菌细胞；最优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞。4.一种表面表达目标糖蛋白的重组水泡性口炎病毒载体，其特征在于，所述重组水泡性口炎病毒载体包含权利要求1所述的核酸分子；优选地，所述病毒载体由如下可操作性相连元件构成：N蛋白、P蛋白、M蛋白、L蛋白、病毒基因组；优选地，所述目标糖蛋白包括Spike蛋白、流感HA蛋白。5.一种CRISPR RNA递送系统，其特征在于，所述递送系统包含权利要求4所述的病毒载体。6.一种权利要求2所述的病毒载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的核酸分子和水泡性口炎病毒G蛋白质粒同时转染到宿主细胞中；优选地，所述方法包括将N蛋白质粒、P蛋白质粒、L蛋白质粒、T7 RNA聚合酶质粒同时转染到宿主细胞中；...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海波，曹彬，邓笑颜，
申请(专利权)人：中日友好医院中日友好临床医学研究所，
类型：发明
国别省市：