一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法技术

本发明专利技术涉及生物领域，本发明专利技术提供一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法。本发明专利技术方法包括使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列，其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列，以替代核内Drosha加工过程，增加干扰RNA切割效率，实现对靶基因的表达干扰的目的。实现对靶基因的表达干扰的目的。实现对靶基因的表达干扰的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法


[0001]本专利技术涉及生物制药领域，具体为干扰RNA，特别涉及干扰RNA以细胞质RNA病毒为载体的递送方法。

技术介绍

[0002]RNA药物是目前被广泛关注的寡核苷酸药物的一种，因其在RNA水平调控疾病相关基因的表达，而被期许有望填补分子水平治疗的领域空白。近年来FDA已批准的多款寡核苷酸药物中，包含多种反义核苷酸药物，通过与靶基因互补产生效用，例如硫代脱氧核苷酸药物Vitravene，通过对人类巨细胞病毒(CMV)mRNA的反义抑制发挥抑制病毒活性的作用，治疗艾滋病(AIDS)病人并发的巨细胞病毒(CMV)性视网膜炎。另外两款siRNA药物：Onpattro和Givlaari相继上市，使得RNA干扰技术抓住众多药企的目光。但是目前所有的商业化RNA药物均是化学合成，需要做结构修饰，脂质体或纳米材料包埋避免制剂降解，成本较高，比如Givlaari的定价为每年57.5万美元。因此，生物载体携带RNA药物的研发思路也逐渐被关注。
[0003]目前优先选择的生物载体为DNA载体和DNA病毒，例如使用最为广泛的腺病毒载体，在分子生物学中被作为常用的工具载体。但DNA病毒通常为入核病毒，会影响宿主基因组稳定性及表达，整合到宿主基因组，生物毒性较大。
[0004]RNA病毒是指以RNA为遗传物质的病毒，不同于DNA病毒的是其遗传物质复制通常发生在胞质中，且可以直接在细胞质中合成酶分子或其他蛋白分子。根据现有的病毒分类方式，RNA病毒又分为了正链RNA病毒、负链RNA病毒和双链RNA病毒，病毒在进入细胞后，其正义链RNA可直接合成复制相关酶，对其遗传物质进行大量扩增，随后表达复制、结构、免疫相关蛋白分子，完成在细胞中的大量扩增、繁殖和释放的工作。
[0005]减毒的RNA病毒是非常良好的生物药载体，它能携带药物进入病灶，并进行大量复制，最终达到给药到靶点，引发自身免疫效应或抑制疾病相关基因的表达，治疗相关疾病的目的。目前多个被改造的减毒RNA病毒药物被报道，并进入临床试验阶段，主要设计方向为减毒病毒疫苗、改造病毒载体表达相关蛋白。RNA病毒多数为细胞质病毒，仅有少数可入核。细胞质RNA病毒作为RNA药物载体，其优势之一是设计方式可以多样化，无论是正链病毒还是负链病毒都可以携带RNA药物分子，从而通过多样的加工方式避免对病毒活性的影响，部分病毒有组织特异性，使得RNA药物分子可以表达于靶点。另外一点是可持续复制表达，可以减小给药量，降低成本。另外RNA病毒通常在胞质中完成该过程，降低了载体病毒对细胞生理以及对内源miRNA生成途径的毒性，不会插入染色体从而影响宿主细胞基因组稳定性，安全性更好。
[0006]但是目前为止细胞质RNA病毒还没有被开发成RNA干扰药物表达载体。因为RNA病毒通常只存在于细胞质中，没有入核过程。正常干扰RNA的加工需要入核，被细胞核中的Drosha识别加工，从mRNA链释放出来，形成shRNA，然后由Exportin 5转运出细胞质，继续被Dicer加工形成双链siRNA，最后由Ago装载其中一条链形成RISC，起到干扰作用。不入核则
仅依靠细胞质中很少量的Drosha难以加工成干扰RNA。再加上RNA病毒需要携带自身复制转录翻译相关的遗传信息，基因组一般会比较大，二级结构复杂，也进一步增加了Drosha识别的难度。因此，理论上RNA病毒不适合作为RNA干扰药物的表达载体。
[0007]由于RNA病毒载体的劣势，所以现有公开资料中采用RNA病毒递送干扰RNA屈指可数，比如细胞质RNA病毒仙台病毒，辛德毕斯病毒，蜱传脑炎病毒，昆津病毒。核质RNA病毒如流感病毒和博尔纳病毒。仙台病毒会导致Drosha蛋白的核定位功能区结构异常，该核酸酶通过核孔渗透释放到胞质中，加上仙台病毒基因组小，结构简单，插入到基因组上的miRNA前体分子易于被加工，弥补病毒无法入核的缺陷。
[0008]辛德毕斯病毒，蜱传脑炎病毒，昆津病毒则有自身独特的加工方式，不依赖于Drosha识别加工。流感病毒和博尔纳病毒虽然也是细胞质RNA病毒，但是可以入核，因此可以被Drosha识别加工。
[0009]但是其他多数细胞质RNA病毒并不具备以上特征，因此难以用于表达干扰RNA。主要障碍在于细胞质中Drosha缺乏，导致干扰RNA加工效率极低，因此需要额外的加工途径来辅助或替代Drosha加工。
[0010]自我剪切型核酶是一类RNA序列，无需蛋白酶加工就可以在自身序列特定位点切割RNA片段。比如有文献报导，在酵母中使用核酶可以表达出具有功能的gRNA。在细胞质RNA病毒中未有应用。
[0011]tRNA是一种由76
‑
90个核苷酸所组成的内源性RNA，主要由RNase P和RNase Z在tRNA特定位点加工，这两种酶主要存在于线粒体，细胞质中。Csy4外源性酶为cas9蛋白的同源蛋白，可以特定识别两个相同的识别位点，在识别序列的第20位碱基剪切。
[0012]文章“A Multi
‑
purpose Toolkit to Enable Advanced Genome Engineering in Plants”中比较过在植物中，这两种加工方式都可以加工出比传统加工方式更高效的gRNA。在细胞质RNA病毒中未有应用。

技术实现思路

[0013]针对现有技术的缺点与不足，本专利技术提供了一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法。具体专利技术如下：
[0014]本专利技术提供一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法，所述方法包括：使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。
[0015]本专利技术中，作为示例性的说明，可以仅在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列；也可以在干扰RNA序列的两端同时插入具有RNA切割活性的RNA序列；还可以在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列，另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。
[0016]作为示例性的说明，本专利技术方法中干扰RNA可以为一个、两个或多个干扰RNA。
[0017]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中的两种或两种以上的组合。
[0018]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述方法包括：在干扰RNA序列两端插入不同的核酶；优选在干扰RNA序列两端分别插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶和锤头型(HH)核酶。
[0019]本专利技术方法中，作为实施方案之一，所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸t本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以细胞质RNA病毒为载体递送干扰RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：使用细胞质RNA病毒作为载体，在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，其中所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶，或它们中的两种或两种以上的组合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在干扰RNA序列两端插入不同的核酶；优选在干扰RNA序列两端分别插入丁型肝炎病毒(HDV)核酶和锤头型(HH)核酶。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点，或它们中两种的组合。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞质RNA病毒选自猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒、非洲猪瘟病毒、新冠病毒、猪流感病毒、经典猪瘟病毒、新城疫病毒；优选猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、麻疹病毒、流感病毒。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述干扰RNA序列插入到细胞质RNA病毒基因组上。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：1)根据不同的适应症选择不同的靶基因；2)根据靶基因序列设计干扰RNA序列，化学合成siRNA oligo，体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性；3)根据siRNA序列设计shRNA序列；4)在siRNA序列或shRNA序列一端或两端插入核酶；然后将所得RNA序列对应的DNA序列构建到细胞质RNA病毒表达载体；其中，当在siRNA序列或shRNA序列一端插入核酶时，在其另一端优选插入tRNA或csy4识别位点；进一步优选在siRNA序列或shRNA序列两端均插入核酶；5)通过病毒拯救获得重组活病毒。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中体外验证siRNA oligo对靶基因的干扰活性进一步包括：化学合成靶基因，通过PCR方法在靶基因上下游引物分别加上酶切位点及保护碱基，之后双酶切PCR片段和载体，连接后获得带有目的基因的载体。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：步骤2)中针对每个靶基因设计干扰RNA序列，在干扰序列3
’
末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链，在此干扰序列的互补序列的3
’
末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，化学合成oligo。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤2)进一步包括以下步骤：(2
‑
1)293T细胞在培养基中培养至80
‑
90％融合时，倾去培养液，PBS洗涤细胞；(2
‑
2)加Trypsin
‑
EDTA溶液,混匀后，吸去胰酶溶液，37℃放置；(2
‑
3)加入完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；(2
‑
4)血球计数板计数，按照每孔约1
×
105的细胞量接种于24孔板；
(2
‑
5)每1OD260 oligo用DEPC
‑
H2O溶解，终浓度约为20μM；(2
‑
6)Lipo2000的转染方法：每组三个重复孔的转染方法：在EP管中加入Opti
‑
MEM I，再加入靶基因质粒，以及相对应的oligo，混匀；在另一EP管中加入Opti
‑
MEM I，以及转染试剂lipo2000，混匀，静置后将两者混匀，室温静置；(2
‑
7)期间将前一天铺好的24孔板中培养基移除，加入培养基；静置后，将转染混合物分别加入到以上的24孔板中，100μl/孔，设3重复，将孔板摇匀，在培养箱中温育6小时；(2
‑
8)移除转染液，用PBS漂洗后，加入培养基继续培养；(2
‑
9)在转染24h后收取细胞，做双荧光素酶检测。11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤3)进一步包括：以siRNA互补序列作为正义链，使用shRNA常用的loop环(TTCAAGAGA)、mir30 loop环序列(GTGAAGCCACAGATG)、或mir155loop环序列(GTTTTGGCCACTGACTGAC)，siRNA序列作为反义链，3
’
末端添加两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸。12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤4)进一步包括：合成(A
‑
B
‑
C)
n
基因片段；其中所述n为1
‑
5之间的整数；所述A或C分别独立地选自具有RNA切割活性的RNA序列或被RNA酶所识别的特征RNA序列，其中A和C不同时为被RNA酶所识别的特征RNA序列；所述B为干扰RNA；优选所述具有RNA切割活性的RNA序列为核酶，所述核酶选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、或窦状芽孢杆菌glmS核酶；优选所述被RNA酶所识别的特征RNA序列选自苯丙氨酸tRNA、或csy4识别位点；优选所述干扰RNA选自siRNA或shRNA或它们的组合；优选所述(A
‑
B
‑
C)
n
基因片段选自HDV
‑
siRNA
–
HH、HDV
‑
siRNA
‑
HHL、(HDV
‑
shRNA
‑
HH)n、HDV
‑
shRNAL
‑
HH、HDV
‑
HDV
‑
shRNA
‑
HH
‑
HH、HDV
‑
HDV
‑
shRNA
‑
HH、HDV
‑
shRNA
‑
HHL、HDV
‑
shRNA
‑
tRNA或Csy4(外源性酶)
‑
HDV
‑
shRNA
‑
csy4(识别位点)等基因片段；通过在PCR引物序列两端添加TRS(转录调控序列)和酶切位点，利用该引物扩增(A
‑
B
‑
C)
n
基因片段，酶切PCR产物，连接到相同酶切的表达载体，获得两端带有核酶，或一端带有核酶而另一端带有tRNA或csy4识别位点的siRNA片段或shRNA片段的病毒表达载体。13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中步骤5)进一步包括：(5
‑
1)将状态良好的细胞铺6孔板，铺板的密度5
×
105个/ml，每孔2ml细胞，放置37℃CO2培养箱中培养24h；(5
‑
2)待细胞融合度达到约80％左右，将上清培养基弃去，用PBS洗涤两遍，加入含有3％FBS的DMEM维持液；(5
‑
3)根据细胞与质粒选择合适的转染试剂，根据转染试剂说明书分别将两端带有核酶、或一端带有核酶而另一端带tRNA或csy4识别位点的siRNA片段或shRNA片段的细胞质RNA病毒表达载体和RFP
‑
靶基因病毒表达载体进行转染，转染96h后观察细胞形态的改变，例如有空泡等病变，记为P0代；(5
‑
4)将P0代病毒液以感染复数为0.1的感染量继续感染重新铺板的细胞，接毒72h后
将细胞放入
‑
20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的病毒液记为P1代病毒；(5
‑
5)再将P1代病毒按照(5
‑
4)方法进行传代依次传至P3代，将含有P3代病毒的细胞放入
‑
20℃冰箱进行反复冻融三次，800g离心5min得到的P3代病毒保存至
‑
80℃冰箱中备用。14.根据权利要求1～13任一所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：所述细胞质RNA病毒为PRRSV，所述干扰RNA为非洲猪瘟病毒的干扰RNA，构建如下干扰RNA表达框架：a)在干扰RNA序列的一端或两端插入具有RNA切割活性的RNA序列；其中当在干扰RNA序列的一端插入具有RNA切割活性的RNA序列时，优选在干扰RNA序列的另一端插入被RNA酶所识别的特征RNA序列；b)然后步骤a)所得干扰RNA与TRS(转录调控序列)结合；或者再进一步在干扰RNA与TRS之间插入EGFP或Csy4外源性酶，或它们两者的组合；所述干扰RNA表达框架插入到PRRSV病毒基因组的负链上。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述具有RNA切割活性的RNA序列选自丁型肝炎病毒(HDV)核酶、锤头型(HH)核酶、发卡核酶、Varkud卫星核酶、CPEB3核酶、CoTC核酶、窦状芽孢杆菌glmS核酶中的一种或多种；优选在干扰RNA两端插入不同种的核酶；进一步优选在干扰RNA两端分别插入丁型肝炎病毒核酶和锤头型核酶。16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA的形式为siRNA(小干扰RNA)、saiRNA(可被Ago2识别加工的RNA序列)、G1、D1、D1L、shRNA(短发夹RNA)、shRNAL，优选siRNA、shRNA，最佳shRNA。17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干扰RNA的靶基因选自非洲猪瘟病毒的如下基因：O174L、EP296R、E165R、K196R、EP152R、CP204L、A240L、MGF360
‑
9L、MGF360
‑
10L、MGF360
‑
11L、MGF360
‑
12L、MGF360
‑
13L、MGF360
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹春来，刘合栋，刘学明，黄国周，王双双，杨晓纯，张鹏，李素雯，梁芷瑜，周翠，何秀仪，
申请(专利权)人：珠海联邦生物医药有限公司珠海联邦制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：