WPRE突变体构建体、组合物及其方法技术

本发明专利技术提供突变的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。具体而言，本发明专利技术涉及可在逆转录病毒载体系统中有效表达感兴趣的核苷酸的突变的WPRE序列。本发明专利技术还涉及向靶细胞递送和表达感兴趣的核苷酸的方法。兴趣的核苷酸的方法。兴趣的核苷酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】WPRE突变体构建体、组合物及其方法


相关申请的交叉引用
[0001]这是一项根据专利合作条约的国际申请，要求于2020年3月11日提交的美国临时专利申请号62/988,202的优先权，其内容透过引用整体并入本文。对电子方式提交的序列表的引用
[0002]序列表的正式副本透过EFS
‑
Web以ASCII格式序列表电子提交，其档案名为“3000011
‑
017977_Seq_Listing_ST25.txt”，创建于2020年3月8日，大小为247,691位元组，与说明书同时提交。此ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，在此以引用的方式全文并入。背景
[0003]1.领域
[0004]本公开涉及一种载体，其包含突变的转录后调控元件。特别地，本专利技术涉及可以在逆转录病毒载体系统中有效表达目的核苷酸的突变WPRE序列。本专利技术还涉及在靶细胞中递送和表达目的核苷酸的方法。
[0005]2.背景
[0006]逆转录病毒载体，例如慢病毒载体，已被提出作为递送系统，用于(尤其是)将目的核苷酸转移至一个或多个目的位元点。
[0007]逆转录病毒载体的一个缺点(无论基于逆转录病毒还是慢病毒)是它们常常不能产生高水平的基因表达，特别是在体内。转录和转录后的许多步骤参与调节基因表达。因此，有可能透过添加已知可在转录后增加基因表达的元件来增强表达逆转录病毒载体递送的转基因。一个实例为表达盒内包含内含子(Choi,T.et al,(1991)Mol.Cell.Biol.9:3070
‑
3074)。体外和体内进行的许多基因转移实验均已证明，存在内含子可以促进基因表达。
[0008]其他类型的元件也可用于在转录后刺激异源基因表达。这些元件与内含子不同，其优点在于它们无需剪接事件。例如，之前的研究表明，乙型肝炎病毒(HBV)转录后调控元件(PRE)和内含子在功能上等效(Huang,Z.M.and Yen,T.S.(1995)Mol.Cell.Biol.15:3864
‑
3869)。与HBV密切相关的土拨鼠肝炎病毒(WHV)也带有PRE(以下简称WPRE；参见美国专利号6,136,597和6,287,814)。WPRE已显示比其HBV对应物更具活性，这与HBVPRE中未发现的其他顺式作用序列存在有关。在慢病毒载体中插入WPRE导致显著刺激跨越不同物种的多种细胞中报告基因(如萤光素酶和绿色萤光蛋白(GFP))的表达(Zufferey,R.et al.(1999)J.Virol 73:2886
‑
2892)。刺激与转导细胞的周期状态无关。
[0009]WPRE包含三个顺式作用序列，其在增强表达水平中的功能起重要作用。但是，它也包含一个大约180个碱基对(bp)的片段，其包括WHV X蛋白开放阅读框的5'末端，以及与其相关的启动子。全长X蛋白与肿瘤发生有关(Flajolet,M.et al.(1998)J.Virol.72:6175
‑
6180)。由于病毒DNA插入宿主基因组而导致myc家族致癌基因顺式启动已知是WHV介导致癌作用的关键机制(Buendia,M.A.(1994)In C.Brechot(ed.),Primary liver cancer:
etiological and progression factors,p.211
‑
224:CRC Press,Boca Raton,Fla.；Fourel,G.(1994)In F.Tronche and M.Yaniv(ed.),Liver gene expression,p.297
‑
343；R.G.Landes Company,Austin,Tex.)。WHV X蛋白的致瘤可能性引起将WPRE纳入逆转录病毒载体的担忧，特别是对于体内应用。
[0010]之前的研究表明，WPRE内X蛋白开放阅读框(ORF)突变降低了X蛋白的致瘤活性，从而提高了其纳入逆转录病毒载体的安全性特征(参见，例如，US 7,419,829；Donello,J.E.et al.(1998)J.Virol.72(6):5085
‑
5092；Schambach,A.et al.(2006)Gene Ther.13:641
‑
645；Zanta
‑
Boussif,M.A.et al.(2009)Gene Ther.16:605
‑
619；Ou L.et al.(2016)Mol.Gen.Metab.Rep.8:87
‑
93)。但是，已在各种突变体WPRE中观察到了对异源基因表达转录后刺激的不一致作用。通常，引入WPRE的突变程度越大，突变体WPRE刺激转录后异源基因表达的效果就越差。
[0011]因此，仍需要安全有效的WPRE用于逆转录病毒载体。简要
[0012]一方面，本申请涉及突变WPRE序列，其用于，例如，逆转录病毒载体(其中WHV X蛋白表达减弱或不存在)。在一些实施方案中，WPRE内任何开放阅读框(ORF)的起始密码子发生突变，WHV X蛋白启动子被删除，且WHV X蛋白OFR被删除。在一些实施方案中，WHV X蛋白启动子和WHV X蛋白起始密码子突变。
[0013]在一些实施方案中，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:1所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106
‑
108、152
‑
154、245
‑
247、272
‑
274、283
‑
285、362
‑
364和603
‑
605的一个或多个起始密码子处包含突变。在一些实施方案中，突变的WPRE序列在对应于根据SEQ ID NO:2所述的WT WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70
‑
72、108
‑
110、121
‑
123、138
‑
140、187
‑
189和428
‑
430的一个或多个起始密码子处包含突变。
[0014]起始密码子可以在一个或多个起始密码子内的一个、两个或所有三个位置处突变。如果一个以上的起始密码子突变，则每个起始密码子突变可以彼此独立。也就是说，WPRE内突变的每个起始密码子不需要以相同的方式发生突变。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子中的每一个在起始密码子内的一个位置处突变。例如，起始密码子的第一个核苷酸可以由“A”突变为“C”、“G”或“T”；或者起始密码子的第二个核苷酸可以由“T”突变为“A”、“C”或“G”，或者起始密码子的第三个核苷酸可以由“G”突变为“A”、“C”或“T”。在一些实施方案中，一个或多个起始密码子由“ATG”突变为“TTG”。在一些实施方案中，一个或多个起始密本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】要求的权利为：1.一种载体，其包含突变的土拨鼠转录后调控元件(WPRE)，其中不包含X蛋白启动子，并且其中所述突变体WPRE不包含X蛋白开放阅读框(ORF)。2.权利要求1的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变。3.权利要求1或2的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变，其中所述一个或多个起始密码子选自对应于根据SEQ ID NO：1所述的野生型WPRE核苷酸序列内核苷酸位置106
‑
108、152
‑
154、245
‑
247、272
‑
274、283
‑
285、362
‑
364和603
‑
605的起始密码子。4.权利要求1或2的载体，其中所述突变体WPRE包含一个或多个起始密码子的突变，其中所述一个或多个起始密码子选自对应于根据SEQ ID NO：2所述的野生型WPRE核苷酸序列内核苷酸位置70
‑
72、108
‑
110、121
‑
123、138
‑
140、187
‑
189和428
‑
430的起始密码子。5.权利要求2
‑
4中任一项的载体，其中一个或多个起始密码子可在起始密码子内的一个、两个或所有三个位置处突变。6.权利要求2
‑
5中任一项的载体，其中一个或多个起始密码子由ATG突变为TTG。7.权利要求1
‑
6中任一项的载体，其中突变体WPRE序列与SEQ ID NO：3具有95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的同一性。8.权利要求1
‑
7中任一项的载体，其进一步包含编码选自由以下组成的组中之蛋白质的核苷酸序列：酶、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化改造免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)、靶蛋白的反式显性负性突变体、毒素、条件毒素、抗原、抗原受体、嵌合抗原受体、T细胞受体(TCR)、肿瘤抑制物蛋白、生长因子、膜蛋白、促血管和抗血管生成蛋白和肽、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶及其衍生物。9.权利要求1
‑
8中任一项的载体，其包含编码蛋白质Z1的第一核苷酸序列S1和编码蛋白质Z2的第二核苷酸序列S2，其中Z1和Z2形成第一二聚体。10.权利要求9的载体，其中第一二聚体Z1Z2为T细胞二聚体信号传导模组、TCR、抗体、抗原受体或嵌合抗原受体。11.权利要求9或10的载体，其中第一二聚体Z1Z2为与靶抗原(TA)肽结合的TCR，并且其中靶抗原(TA)肽为病毒肽、细菌肽或肿瘤相关抗原(TAA)抗原肽。12.权利要求9
‑
11中任一项的载体，其中所述第一二聚体Z1Z2选自SEQ ID NO：13和14、15和16、17和18、19和20、21和22、23和24、25和26、25和92、91和92、27和28、29和30、31和32、33和34、35和36、37和38、39和40、41和42、43和44、45和46、47和48、49和50、51和52、53和54、55和56、57和58、59和60、61和62、63和64、65和66、67和68、69和70、71和72、73和74、75和76、77和78、79和80、81和82、83和84、85和86、87和88或89和90。13.权利要求9
‑
12中任一项的载体，其进一步包含编码蛋白质Z1的第三核苷酸序列S3和编码蛋白质Y2的第四核苷酸序列S4，其中Y1和Y2形成第二二聚体，其中所述第一二聚体Z1Z2在结构上不同于第二二聚体Y1Y2。14.权利要求13的载体，其中第二二聚体Y1Y2为TCR共受体。15.权利要求13或14的载体，其中第二二聚体Y1Y2为SEQ ID NO：11和12。16.权利要求1
‑
15中任一项的载体，其进一步包含编码2A肽的核苷酸序列和编码连接
子肽的核苷酸序列。17.权利要求1
‑
16中任一项的载体，其进一步包含编码弗林蛋白酶肽(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列。18.权利要求1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：伊玛提克斯美国公司，
类型：发明
国别省市：