用于AAV基因治疗的无CpG的ITR制造技术

本发明专利技术公开了重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，包含不含5'

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于AAV基因治疗的无CpG的ITR
[0001]关于联邦资助的研究或开发的声明
[0002]本专利技术是在政府支持下，由美国国立卫生研究院授予的编号为NS090634和AR070517的支持下以及陆军医学研究和物资司令部授予的编号为W81XWH
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0302的支持下完成的。政府对这项专利技术享有一定的权利。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]本申请要求序列号为63/006,148、申请日为2020年4月7日的美国临时申请的权利，其全部内容通过引用并入本文
[0005]序列表的引入
[0006]本文提供了序列表的纸质副本和计算机可读形式的序列表，其中计算机可读形式的序列表包含名为“20UMC037_ST25.txt”的文件，大小为5,645字节(在MICROSOFTEXPLORER中显示)，并通过引用将其并入本文。该序列表由SEQ ID NO:1
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19组成。

技术介绍

[0007]本公开总体上涉及重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其包含不含5'
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胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤
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3'(CpG)基序的末端反向重复序列(ITR)(即，ITR不包括任何CpG基序)。更具体地，本公开涉及包含rAAV载体的rAAV颗粒，涉及用于递送核酸的组合物和方法，以及涉及用于基因治疗的组合物和方法。本公开还涉及使用rAAV载体通过AAV基因疗法治疗疾病的组合物和方法。/>[0008]腺相关病毒(AAV)是一种辅助依赖性细小病毒，最早在腺病毒制剂中作为污染颗粒被发现。AAV含有一个约4.7kb的单链DNA基因组。AAV是在80年代末和90年代初开发的一种基因传递/基因治疗载体。监管机构已批准三种AAV载体用于治疗遗传性疾病。其中包括用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症的Glybera、用于治疗莱伯氏先天性黑蒙症的Luxturna(Voretigene neparvovec
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rzyl)和用于治疗脊髓性肌萎缩症的Zengensma(Onasemnogene abeparvovec
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xioi)。AAV基因疗法在许多其他遗传性疾病中也取得了显著的临床成功，如血友病A、血友病B、X连锁肌管型肌病和巨轴索神经病。
[0009]rAAV载体是通过用转基因表达盒替换野生型AAV复制(Rep)和结构/衣壳(Cap)开放阅读框而产生的。两个反向末端重复序列(ITR)是rAAV载体中唯一的野生型病毒序列(图1A)。每个ITR由核苷酸组成，这些核苷酸以翻转(flip)或反转(flop)构型形成T形发夹结构。
[0010]ITR对于野生型AAV和rAAV基因组复制、子代基因组生成和封装进衣壳以及单链载体基因组转化为具有转录能力的潜活形式的持续转基因表达都是必不可少的。AAV载体的生产依赖于载体基因组从双链前病毒质粒(顺式质粒,cis
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plasmid)中的成功拯救，随后通过自引发机制对载体基因组进行复制，并且将单链基因组置换和封装到预组装的衣壳中。ITR对所有这些进程都至关重要。具体来说，大Rep蛋白结合RBE和RBE'元件。这些相互作用使大的Rep蛋白在末端分离位点(trs)形成序列特异性和链特异性切口。通过该切割产生的
游离3'OH基团用作合成次级ITR的复制引物。进一步复制导致新互补链的产生和原始互补链的置换。移位的链(载体基因组)通过5倍通道被小Rep蛋白沿3'至5'方向泵入预先形成的空衣壳中。除了在载体生产中发挥关键作用外，ITR对AAV转导也很重要。载体基因组的ITR引发的单链到双链转化是转基因转录的先决条件。持续性AAV转导(持续性转基因表达)也依赖于ITR间重组和随后形成的游离型环状AAV基因组。
[0011]尽管在将AAV基因治疗从实验室转移到病床方面取得了重大进展，但仍存在重大障碍。其中包括免疫应答。AAV最初被认为是一种免疫原性弱的载体。然而，最新的动物研究结果和临床试验数据表明，AAV载体可以通过先天性和适应性免疫机制诱导显著的免疫应答。
[0012]这些缺点强调了开发新的、增强的AAV基因治疗技术的必要性。因此，亟需开发具有改进的免疫原性特性的AAV基因治疗载体。
[0013]ITR的基因修饰可能代表一种降低AAV载体免疫原性的方法。不幸的是，众所周知，ITR诱变与功能缺陷有关。
[0014]通过诱变，ITR的结构
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功能关系已被广泛质疑。大多数ITR突变是有害的。它们对AAV复制和/或封装进衣壳产生负面影响(Ryan等人，1996；Wang等人，1998；Brister和Muzyczka，1999；2000；McCarty等人，2003；Zhong等人，2008；Zhou等人，2008；Ling等人，2015；Zhou等人，2017)。RBE的二核苷酸颠换突变使Rep结合减少2至10倍(Ryan等人，1996)。RBE核心序列的单核苷酸颠换突变导致Rep结合减少多达5倍(Ryan等人，1996)。trs的单核苷酸颠换突变几乎消除了大Rep蛋白的ITR切口(Brister和Muzyczka，1999)。B臂和C臂的截断导致AAV复制减少8倍(Zhou等人，2017)。在一个ITR中trs的缺失完全阻止了来自突变的ITR的AAV基因组复制(McCarty等人，2003；McCarty，2008)。D
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序列的缺失和/或取代使得AAV仅包装正链或负链基因组，而不是两者(Zhong等人，2008；Zhou等人，2008；Ling等人，2015年)。有缺陷的ITR也与非载体序列的包装有关(Wang等人，1996；Wang等人，1998；Savy等人，2017；Tai等人，2018)。总之，这些研究揭示了在AAV基因治疗中保持完整ITR的重要性。

技术实现思路

[0015]本公开总体上涉及不含5'
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胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤
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3'(CpG)基序的末端反向重复序列(ITR)(即，ITR不包括任何CpG基序)。更具体地，本公开涉及重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，包括无CpG基序的ITR(即，ITR不包括任何CpG基序)。本公开还涉及包含所述rAAV载体的rAAV颗粒和药物组合物。本公开还涉及递送核酸的方法和AAV基因治疗的方法。本公开还涉及使用rAAV载体用AAV基因疗法治疗疾病的组合物和方法，其中rAAV载体的ITR不含CpG基序(即ITR不包括任何CpG基序)。
[0016]在一个方面，本公开涉及不含5'
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胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤
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3'(CpG)基序的末端反向重复序列(ITR)(即，ITR不包括任何CpG基序)。
[0017]一方面，本公开涉及重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，包含不含5'
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.不含5'
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胞嘧啶
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磷酸
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鸟嘌呤
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3'(CpG)基序的末端反向重复序列(ITR)。2.根据权利要求1所述的ITR，与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一个具有约70％至约90％的序列同一性。3.根据权利要求1所述的ITR，包含约100至约200个核酸。4.根据权利要求1所述的ITR，包含小于70％的GC含量。5.根据权利要求1所述的ITR，包含含有转换突变的Rep结合元件(RBE)。6.根据权利要求1所述的ITR，其中所述ITR是5'端ITR或3'端ITR。7.根据权利要求1所述的ITR，其中所述ITR是5'端ITR，所述5'端ITR包括在所述5'端ITR的A段中的第一CpG基序中的鸟嘌呤至胸腺嘧啶取代。8.根据权利要求7所述的ITR，其中所述ITR是5'端ITR，所述5'端ITR包括A段中3个剩余CpG基序中的鸟嘌呤至腺嘌呤取代。9.根据权利要求8所述的ITR，其中5'
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端ITR的A'、B'和C'段中的相应碱基被互补碱基取代。10.根据权利要求1所述的ITR，其中所述ITR是3'端ITR，所述3'
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端ITR包括在所述3'
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端ITR的A段中的第一CpG基序中的鸟嘌呤至胸腺嘧啶取代。11.根据权利要求10所述的ITR，其中所述ITR是3'端ITR，所述3'
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端ITR包括在所述3'端ITR的A段中的3个剩余CpG基序中的鸟嘌呤至腺嘌呤取...

【专利技术属性】
技术研发人员：段东升，潘秀芳，岳永平，
申请(专利权)人：密苏里大学管理机构，
类型：发明
国别省市：