防止重结晶的冷冻保存培养基和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基。该培养基包含亲水且无毒的聚合物或其他高分子、含水液体和冷冻保护剂。高分子的分子在溶解于所述含水液体中时形成形状为球形的致密的三维结构。本发明专利技术的培养基可以用于在非低温温度下长期贮存细胞，结果类似于在低温温度下贮存所见的结果。

Medium and Method for Preventing Recrystallization in Freezing Preservation

The present invention relates to a medium for preserving cells at non-cryogenic freezing temperature. The medium contains hydrophilic and non-toxic polymers or other polymers, aqueous liquids and cryoprotectants. When the polymer molecule is dissolved in the water-bearing liquid, a compact three-dimensional structure with a spherical shape is formed. The culture medium of the invention can be used for long-term storage of cells at non-low temperature, and the results are similar to those observed at low temperature.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】防止重结晶的冷冻保存培养基和方法对相关申请的交叉引用本申请基于并要求2016年5月13日提交的美国临时申请序列号62/336,142的优先权，该临时申请通过引用并入本文。专利技术背景1.专利
本专利技术涉及低温生物学和冷冻保存领域。2.相关技术的描述目前细胞储液的长期贮存通常需要使用液氮(LN2)，由于通常使用的含有细胞膜渗透性冷冻保护剂的冷冻保存培养基在非低温温度，例如-80℃下冷冻时是热不稳定的，在大多数实验室深度冷冻器提供的贮存条件下，导致冰重结晶并导致细胞存活力随时间逐渐丧失。细胞贮存对LN2的依赖性显著增加运营费用，并引发了许多与工作效率和安全性受损相关的问题。两种通用方法广泛用于冷冻保存：平衡(慢速冷冻)和非平衡(玻璃化)冷却程序。玻璃化方法及其“缓慢玻璃化”变型不仅引入由使用高浓度(通常40-50％v/v)的渗透性冷冻保护剂所致的细胞渗透损伤和毒性，而且需要供应LN2或其他低温液体在低温温度，例如在1个大气压下的LN2饱和温度(-196℃)或LN2蒸汽(通常为-120℃)下实现和维持胞内和胞外溶液两者的玻璃化。对于慢速冷冻方法，首先将细胞加载相对低浓度(通常为10％v/v)的冷冻保护剂，然后缓慢冷却至中间非低温温度，例如在深度冷冻器中-80℃。在冷却期间，冰沉淀逐渐增加溶质浓度，使得在达到中间温度后，含有细胞的残留溶液高度浓缩并处于粘性液体状态。此类部分冷冻系统中的胞外冰是不稳定的，并且在冷却期间形成的小冰晶自发地开始合并并形成较大的晶体以使其表面能最小化并逐渐分布在整个样品中。此类事件，即所谓的重结晶对接触出现的大晶体的细胞造成严重的机械损伤，或者引入致命的胞内冰形成。尽管这种细胞破坏过程非常缓慢(通常在数周而不是数小时内发生)，但是即使在低至-80℃的温度下，它也是渐进的。许多出版物在科学研究文章或冷冻保存培养基产品手册中证明，目前在-80℃深度冷冻器中的贮存仅适用于临时或短期使用目的。因此，为了在-80℃缓慢冷冻细胞后实现细胞的长期贮存，必需进行将样品冷却至低温温度的第二步。抗冻蛋白和某些小分子能够通过诱导热滞后来淬灭冰重结晶，但是此过程仅在刚好低于冰熔点的温度范围内发生并且在更低的温度下无效。已经开发了各种聚合物和相关方法，以通过在液氮中贮存后增加溶液粘度或改善细胞膜稳定性来改善融解后细胞存活力和功能。然而，目前，通过使用这些聚合物和方法在-80℃长期贮存后，对于研究和生物医学应用两者非常有价值的许多细胞类型的低存活率尚未有显著改善。用于冷冻保存的这些广泛使用的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基淀粉(HES)等的应用不足以防止在非低温温度下冷冻保护剂溶液的重结晶。专利技术概述本专利技术涉及用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基，其包含在溶解于含水液体中时形成形状为球形的致密三维结构的高分子。本专利技术还涉及包含本专利技术培养基的培养基-细胞悬浮液，其具有悬浮于培养基中的细胞。本专利技术还涉及使用本专利技术的培养基来保存细胞的方法。在非低温冷冻温度下，致密且球形的结构在具有细胞的培养基的未冷冻部分中浓缩，并且这种拥挤效应防止在非低温温度下贮存期间的冰重结晶。在本专利技术的某些方面，培养基包括亲水且无毒的高分子、含水液体和冷冻保护剂。高分子在培养基中的浓度可以等于或大于约20％(w/v)、约25％(w/v)或更大、约35％(w/v)或更大或约50％(w/v)或更大。在本专利技术的某些方面，冷冻保护剂的浓度等于或大于培养基中高分子浓度的约20％、等于或大于培养基中高分子浓度的约50％、等于或大于培养基中高分子浓度的约75％、或等于或大于培养基中高分子浓度的约100％。在本专利技术的某些方面，高分子是聚合物。聚合物可以包含在溶解于所述含水液体中时形成形状呈大致球形的致密三维结构的分子。在此类实施方案中，聚合物选自下组：球形亲水性多糖、聚合的环糊精或糖类、球状蛋白质或球形蛋白质、通过将寡糖链附着到那些球状蛋白质形成的球形糖蛋白、那些球状蛋白质的其他衍生物及其组合。聚合物可以是亲水性多糖，并且可以通过蔗糖和表氯环氧丙烷(epichlorohydrin)的共聚合形成。在本专利技术的某些方面，冷冻保护剂选自二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇及其组合。在本专利技术的某些方面，含水液体选自下组：细胞培养基、营养培养基、盐水及其组合。含水液体可以选自下组：血清、FBS(胎牛血清)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、FHM(冲洗-保持培养基(flushing-holdingmedium))、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)、RPMI(RoswellParkMemorialInstitute培养基)、BF5培养基、EX-CELL培养基、溶原性肉汤(LB)培养基、CaCl2水溶液、NaCl水溶液、KCl水溶液及其组合。在本专利技术的某些方面，悬浮细胞是真核细胞。真核细胞可以是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以选自下组：鼠细胞、猪细胞、人细胞及其组合。哺乳动物细胞可以选自下组：干细胞、体细胞、繁殖细胞及其组合。在本专利技术的其他方面，悬浮细胞是原核细胞。在本专利技术的某些方面，致密的大致球形结构在其最宽尺寸上为约100nm(纳米)或更小，包括在其最宽尺寸上范围为约1至50nm的结构或包含在其最宽尺寸上范围为约5至10nm的结构。在本专利技术的某些方面，培养基基本上不含血清、动物蛋白质或人蛋白质。本专利技术的某些方面涉及在非低温冷冻温度下保存细胞的方法，其包括：提供冷冻保存培养基，其包含亲水且无毒的高分子、冷冻保护剂和含水液体。在某些实施方案中，高分子在所述培养基中的浓度大于约10％(w/v)，并且高分子在溶解于所述含水液体中时形成高度致密的大致球形结构。将细胞添加到培养基中以形成培养基-细胞悬浮液。将培养基-细胞悬浮液冷却至非低温冷冻温度，其中非低温冷冻温度为约-85℃或更大。可以于或接近所述非低温冷冻温度或不同的非低温冷冻温度将所述培养基-细胞悬浮液维持长于三周的时间段，而将所述细胞的融解后细胞存活率维持为与将所述细胞在液氮中贮存所述时间段获得的融解后细胞存活率相等或大致相同。在该方法的某些方面，高分子是聚合物。在方法的某些方面，冷冻保存培养基中聚合物或其它高分子的浓度范围为聚合物在含水液体中的溶解度的约10％，或范围为20％至50％。在方法的某些方面，添加到培养基的细胞在细胞的第一悬浮液中，其中冷冻保存培养基与细胞的第一悬浮液的所述体积比为约10:1至1:5或3:2至1:5。在本专利技术的某些方面，将培养基-细胞悬浮液贮存约3周的时间段并延长长达至少1年，而将所述细胞的融解后细胞存活率维持为与将所述细胞在液氮中贮存所述时间段获得的融解后细胞存活率相等或大致相同。在某些实施方案中，时间段是1年或更多、5年或更多、或10年或更多。在某些实施方案中，融解后细胞存活率等于或大于将所述细胞在液氮中贮存相同时间段获得的存活率的约70％。在某些实施方案中，非低温温度范围为-100℃至-20℃，范围为-85℃至-65℃，或范围为-80℃至-75℃。在某些实施方案中，以约0.01℃/min-1000℃/min的速率、约0.1-10℃/min的速率或约0.5-1℃/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基，其包含：亲水且无毒的高分子；含水液体；和冷冻保护剂；其中所述高分子在所述培养基中的浓度等于或大于约20％(w/v)，且其中所述高分子的分子在溶解于所述含水液体中时形成形状为球形的致密的三维结构。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.13 US 62/336,1421.用于在非低温冷冻温度下保存细胞的培养基，其包含：亲水且无毒的高分子；含水液体；和冷冻保护剂；其中所述高分子在所述培养基中的浓度等于或大于约20％(w/v)，且其中所述高分子的分子在溶解于所述含水液体中时形成形状为球形的致密的三维结构。2.权利要求1的培养基，其进一步包含悬浮于所述培养基中的所述细胞。3.权利要求2的培养基，其中在所述非低温冷冻温度下，所述致密且球形的结构在具有所述细胞的所述培养基的未冷冻部分中浓缩，并且其中拥挤效应防止在所述非低温温度下贮存期间的冰重结晶。4.权利要求1-3中任一项的培养基，其中所述培养基中所述高分子的浓度为约25％(w/v)或更大。5.权利要求4的培养基，其中所述培养基中所述高分子的浓度为约35％(w/v)或更大。6.权利要求5的培养基，其中所述培养基中所述高分子的浓度为约50％(w/v)或更大。7.权利要求1-6中任一项的培养基，其中所述冷冻保护剂的浓度等于或大于所述培养基中所述高分子浓度的约20％，优选等于或大于约50％。8.权利要求7的培养基，其中所述培养基中所述冷冻保护剂的所述浓度等于或大于所述培养基中所述高分子浓度的约75％。9.权利要求8的培养基，其中所述培养基中所述冷冻保护剂的所述浓度等于或大于所述培养基中所述高分子浓度的约100％。10.权利要求1-9中任一项的培养基，其中所述高分子是聚合物。11.权利要求10的培养基，其中所述聚合物包含在溶解于所述含水液体中时形成形状呈大致球形的所述致密三维结构的分子。12.权利要求11的培养基，其中所述聚合物选自下组：球形亲水性多糖、聚合的环糊精或糖类、球状蛋白质(globularprotein)或球形蛋白质(spheroprotein)、通过将寡糖链附着到那些球状蛋白质形成的球形糖蛋白、那些球状蛋白质的其他衍生物及其组合。13.权利要求12的培养基，其中所述聚合物是亲水性多糖。14.权利要求13的培养基，其中所述聚合物是通过蔗糖和表氯环氧丙烷(epichlorohydrin)的共聚合形成的聚合物。15.权利要求1-14中任一项的培养基，其中所述冷冻保护剂选自下组：二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇及其组合。16.权利要求1-15中任一项的培养基，其中所述含水液体选自下组：细胞培养基、营养培养基、盐水及其组合。17.权利要求16的培养基，其中所述含水液体选自下组：血清、FBS(胎牛血清)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、FHM(冲洗-保持培养基)、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)、RPMI(RoswellParkMemorialInstitute培养基)、BF5培养基、EX-CELL培养基、溶原性肉汤(LB)培养基、CaCl2水溶液、NaCl水溶液、KCl水溶液及其组合。18.权利要求2-17中任一项的培养基，其中所述悬浮细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞。19.权利要求18的培养基，其中所述悬浮细胞是哺乳动物细胞，并且所述哺乳动物细胞选自下组：鼠细胞、猪细胞、人细胞及其组合。20.权利要求18或19的方法，其中所述哺乳动物细胞选自下组：干细胞、体细胞、繁殖细胞及其组合。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩旭，袁野，RM罗伯茨，
申请(专利权)人：密苏里大学管理机构，
类型：发明
国别省市：美国,US