用于活化、修饰和扩增γδT细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法技术

本公开内容涉及T细胞的扩增和活化。一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和活化。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的扩增和活化，同时消耗α‑和/或β‑TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和消耗或减少的α‑和/或β‑TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于活化、修饰和扩增γδT细胞治疗癌症和相关恶性肿瘤的方法相关申请的交叉引用本文为专利合作条约下的国际申请，要求11月27日提交的美国临时申请序列号62/591,041的权益，2017年11月27日提交的德国申请102017127984.9，其内容通过引用整体并入本文。背景1.
本公开内容涉及T细胞的扩增和活化。一方面，本公开内容涉及可用于转基因表达的γδT细胞的扩增和活化。另一方面，本公开内容涉及γδT细胞的扩增和活化，同时消耗α-和/或β-TCR阳性细胞。本公开内容还提供了包含扩增的γδT细胞和消耗或减少的α-和/或β-TCR阳性细胞的T细胞群。本公开还提供了使用所公开T细胞群的方法2.技术背景γδT细胞代表表达γδTCR而非αβTCR的T细胞子集。γδT细胞可分为两个主要子集：与组织结合的Vδ2阴性细胞和外周循环中的Vδ2阳性细胞，更具体地说是Vγ9δ2。两个子集已被证明都具有抗病毒和抗肿瘤活性。与常规表达αβTCR的细胞不同，表达γδTCR的细胞识别其靶标而不依赖于经典的MHCI和II。与自然杀伤(NK)T细胞相似，γδT细胞表达NKG2D，其结合于非经典MHC分子，即，存在于受应激细胞和/或肿瘤细胞上的MHCI类多肽相关序列A(MICA)和MHCI类多肽相关序列B(MICB)。γδTCR识别多种配体，例如，应激和/或肿瘤相关的磷酸抗原。γδT细胞透过多种机制(即TRAIL，FasL，穿孔素和颗粒酶分泌)介导其靶标的直接细胞溶解。此外，表达CD16的γδT细胞增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。γδT细胞(外周血中可能通常仅存在1％至5％的量)的一个问题是不能确保有足量用于医学治疗的γδT细胞的纯度和数量，尤其是因为只收集了少量血液，然后活化和/或增殖其中的细胞。增加患者采集血液量以确保足以用于医学治疗的γδT细胞的纯度和数量也带来了一个问题，即它给患者带来了很大的负担。迄今为止，使用自体Vγ9δ2T细胞的临床试验可能使用Vγ9δ2T细胞扩增方案，该方案是用双膦酸盐(即唑来膦酸盐和帕米膦酸盐)和100U/mlIL-2处理PBMC14天。该过程最多在14天内可使总Vγ9δ2T细胞增加100倍；此后，扩增率降低，这与细胞死亡的增加相一致。因此，传统Vγ9δ2扩增方案可能无法产生足够数量的细胞以符合商业上可行的同种异体产品。美国专利7,749,760描述了含有双膦酸盐，白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素18(IL-18)的Vγ9Vδ2T细胞增殖剂。美国专利8,962,313描述了通过向分离的外周血液中添加疾病抗原并在含有白细胞介素的培养基中培养所得的组合来同时增殖疾病抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和γδT细胞的方法。WO2014/072446描述了使用γδT细胞活化剂和IL-33的组合诱导γδT细胞的无IL-2增殖的方法，其用于的治疗感染、癌症、自身免疫性以及其他疾病。WO2016/166544描述了γδT细胞可在磷酸抗原异戊烯焦磷酸(IPP)的存在下扩增，并可在培养步骤中提供细胞因子以促进γδT细胞的增殖并维持外周血单核细胞的细胞表型。美国专利2011/0158954描述了一种制备γδT细胞群的方法，其中该方法包括在(a)纤连蛋白，纤连蛋白片段或其混合物和(b)中γδT细胞活化因子存在下培养含有γδT细胞的细胞群的步骤。美国专利2016/0175358描述了在收集的γδT细胞上表达的细胞表面标志物的阳性和/或阴性选择可用于直接从各种来源分离γδT细胞，例如：外周血样本、脐带血样本、肿瘤、肿瘤活组织检查、组织、淋巴、或来自受试者的上皮样本。基于CD4、CD8、TCRα、TCRβ、TCRδ和其他合适的细胞表面标志物的阳性或阴性表达，可以从复杂样本中分离γδT细胞。仍然需要能够制备足够数量的γδT细胞作为商业上可行的治疗产品的方法。权利要求中描述的实施方案提供了该技术问题的解决方案。简要概述一方面，本公开内容提供了活化和/或扩增γδT细胞的方法，包括从人受试者的血液样本中分离γδT细胞，在存在氨基二膦酸盐和细胞因子化合物或组合物的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在氨基二膦酸盐和存在细胞因子化合物或组合物的情况下扩增活化的γδT细胞。一方面，本申请涉及扩增和活化γδT细胞的方法，包括从人受试者的外周血单核细胞(PBMC)中分离γδT细胞，其中分离包括使PBMC与抗-α和抗-βT细胞受体(TCR)抗体(例如，生物素或磁珠缀合的抗-αβTCR抗体)接触，从PBMC中消耗α-和/或β-TCR阳性细胞，例如，透过使用链霉抗生物素蛋白-微珠或磁体，在至少一种含有氨基二膦酸盐和/或磷酸抗原的化合物和至少一种包含人重组白细胞介素2(IL-2)和/或人重组白细胞介素15(IL-15)(例如，单独的IL-2、单独的IL-15、或IL-2和IL-15的组合)的细胞因子存在的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在至少一种化合物和存在至少一种细胞因子的情况下扩增活化的γδT细胞。另一方面，本公开内容涉及扩增和活化γδT细胞的方法，包括从人受试者的白细胞分离术中分离γδT细胞，其中分离包括使白细胞分离产物与抗-α和抗-βT细胞受体(TCR)抗体(例如，生物素或磁珠缀合的抗-αβTCR抗体)接触，从PBMC中例如透过使用链霉抗生物素蛋白-微珠或磁体消耗α-和/或β-TCR阳性细胞，在至少一种包含氨基二膦酸盐和/或磷酸抗原的化合物和至少一种包含IL-2和/或IL-15的细胞因子存在的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在至少一种化合物和存在至少一种细胞因子的情况下扩增活化的γδT细胞。再一方面，本公开内容提供了活化和扩增γδT细胞的方法，包括从人受试者的血液样本中分离γδT细胞，在存在氨基二膦酸盐，Toll样受体2(TLR2)配体和基本上由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物的情况下活化分离的γδT细胞，并且在不存在氨基二膦酸盐和存在所述细胞因子组合物的情况下扩增活化的γδT细胞。一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法活化T细胞的方法。另一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法扩增T细胞的方法。再一方面，本公开内容提供了透过利用本文描述的方法活化和扩增T细胞的方法。一方面，分离的γδT细胞是在存在唑来膦酸、TLR2配体和由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物的情况下活化。另一方面，细胞因子组合物由IL-2或IL-15组成。一方面，本文描述的方法为体外方法。一方面，γδT细胞分离自受试者(例如人受试者)的白细胞分离产物，例如，另一方面，γδT细胞不是从外周血单核细胞(PBMC)(例如脐带血)中分离的。一方面，血液样本包含外周血单核细胞(PBMC)和/或白细胞分离产物。另一方面，α-和/或β-TCR阳性细胞包括αβT细胞和天然杀伤T(NKT)细胞。再一方面，氨基二膦酸盐可能是唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐、膦酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.权利要求内容为： /n一种活化和扩增γδT细胞的体外方法，包括/n从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，/n在存在氨基二膦酸盐、人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下活化所述分离的γδT细胞，和/n在不存在氨基二膦酸盐和存在人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下扩增所述活化的γδT细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171127 DE 102017127984.9;20171127 US 62/591,0411.权利要求内容为：
一种活化和扩增γδT细胞的体外方法，包括
从人体受试者的血液样本中分离γδT细胞，
在存在氨基二膦酸盐、人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下活化所述分离的γδT细胞，和
在不存在氨基二膦酸盐和存在人重组白细胞介素2(IL-2)和人重组白细胞介素15(IL-15)的情况下扩增所述活化的γδT细胞。


2.根据权利要求1的方法，其中所述γδT细胞从白细胞分离术人样本中分离。


3.根据权利要求1或2的方法，其中所述氨基二膦酸盐包括帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、恩加膦酸、其盐和/或其水合物。


4.根据权利要求1至3任一项中所述的方法，其中所述氨基二膦酸盐是唑来膦酸。


5.根据权利要求1至4任一项中所述的方法，其中活化存在唑来膦酸和由IL-2和IL-15组成的细胞因子组合物。


6.根据权利要求1至5任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在Toll样受体2(TLR2)配体。


7.根据权利要求6的方法，其中所述TLR2配体选自两性霉素B、L-茶氨酸、单宁和多酚组成的组。


8.根据权利要求1至7任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在N-乙醯半胱氨酸(NAC)。


9.根据权利要求1至8任一项中所述的方法，其中所述活化进一步存在COX-2抑制剂。


10.根据权利要求9的方法，其中所述COX-2抑制剂是布洛芬。


11.根据权利要求1至10任一项中所述的方法，其中活化存在唑来膦酸，浓度为约1μM至约10μM。


12.根据权利要求1至11任一项中所述的方法，其中活化存在IL-2，浓度为约10IU/ml至约100IU/ml。


13.根据权利要求1至10任一项中所述的方法，其中活化存在浓度为约1μM至约100μM的唑来膦酸、浓度为约10IU/ml至约200IU/ml的IL-2和浓度为约10-500ng/ml的IL-15。


14.根据权利要求1至10任一项和权利要求13中所述的方法，其中扩增存在浓度为约10IU/ml至约100IU/ml的IL-2和/或浓度为约50-200ng/ml的IL-15。


15.一种透过权利要求1至14任一项所述的方法制备的扩增γδT细胞群，其中所述扩增γδT细胞的密度为至少约1x105个细胞/ml、至少约1x106个细胞/ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·道，M·玛塔，A·诺维卡，Y·布拉德，S·瓦尔特，S·米赛尔，S·库特拉夫·科奎，N·希尔夫，
申请(专利权)人：伊玛提克斯美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US