评估病毒载体效力的方法技术

本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于免疫疗法的T细胞及其方法。另一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。

Methods for evaluating the efficacy of viral vectors

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评估病毒载体效力的方法相关申请的交叉引用这是专利合作条约下的国际申请，要求享有2018年1月17日提交的美国临时申请序列号62/618,295和2018年1月17日提交的德国申请102018100967.4的权益，其内容是本文通过引用整体并入。背景1.
本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于癌症免疫疗法的T细胞及其方法。一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。另一方面，本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。2.技术背景藉由治疗目的用之病毒载体或病毒递送基因的挑战是临床剂型的制备和精确定量。病毒疫苗、使用病毒载体的重组蛋白和病毒抗原的生产都需要量化病毒来不断调整和监测过程，以优化产量并回应不断变化的需求和应用。病毒滴度测定或病毒定量涉及计数特定体积的病毒数量以确定病毒浓度。传统方法包括病毒噬斑测定(确定病毒样本中噬斑形成单位(pfu)的数量)和组织培养感染剂量(TCID50)或荧光活性感染剂量(FAID50)(测量感染性病毒滴度)。该TCID50测定法可定量杀死50％受感染宿主细胞或在50％接种组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。传统方法通常检测慢且为劳动密集型，并且受到包括测定间高度变异性的限制。酶联免疫吸附测定(ELISA)是蛋白质测定更现代的演变方法，其利用与酶连接的特异性抗体来检测样本中是否存在未知量的抗原(即病毒)。透过酶将试剂转化为可检测信号的能力来检测和/或定量抗体-抗原结合事件，所述可检测信号可用于计算样本中抗原的浓度。基于使用ELISA的免疫荧光检测法开发了病毒滴度测定的平板测定法，但是，这些方法是用于定量来自病毒样本的蛋白质而不是定量感染性病毒。流式细胞术或FACS(荧光激活细胞分选术)测定法已用于测量相对较高感染复数(MOI)下感染的细胞培养物中受感染细胞的数量。例如，美国专利号6,248,514描述了使用流式细胞术分析使用特定范围的病毒颗粒浓度和吸附时间感染的细胞产率。美国专利号7,476,507描述了用于测定受圆环病毒感染的宿主动物宿主细胞培养物的病毒滴度的基于FACS的方法。但是，对于许多应用，流式细胞仪器的成本、尺寸和复杂性阻碍了更广泛的使用。评估逆转录病毒载体滴度的方法通常可分为功能性和非功能性滴定方法。非功能性滴定方法可包括p24抗原ELISA、逆转录酶(RT)活性的评估，以及透过半定量northern印迹、斑点印迹分析或RT-qPCR测定载体制剂中的基因组RNA浓度。有时这些技术高估了功能性载体滴度并存在某些缺点。例如，定量的p24蛋白质库可包括可变数量的游离p24和非功能性载体颗粒的p24。类似地，RNA滴度可评估缺陷颗粒，而RT测定可以证明RT活性。可以透过限制稀释载体后转导细胞并随后评估报告蛋白活性(例如β-半乳糖苷酶阳性细胞)或透过评估抗生素选择后菌落形成单位的数量来确定更准确的功能性滴度。用于量化功能性载体滴度的更广泛和直接的技术可以使用eGFP荧光和荧光激活细胞分选术(FACS)。但是，转基因表达的FACS分析可能仅限于荧光报告蛋白，并且可能无法区分单次或多次整合的细胞。US20170166866描述了转导原代T淋巴细胞的方法，包括使原代T淋巴细胞与病毒载体(例如慢病毒载体)和是先天免疫系统抑制剂的化合物接触，所述病毒载体含有感染复数(MOI)为1.5-2.5的核酸，从而将核酸转导入T淋巴细胞中。US20170023570描述了定量样本中感染性病毒颗粒的高通量方法。这种病毒定量方法包括以下步骤：1)提供含有病毒的样本；2)制备样本的连续稀释液；3)用病毒感染宿主细胞并培养培养物；4)使受感染细胞中的病毒所表达的抗原与用荧光标记物标记的抗体发生反应；5)确定感染细胞的数量；和6)确定样本中的病毒滴度。仍然需要开发更好的方法来评估用于免疫疗法之T细胞制造过程中病毒转导的最佳病毒浓度。本领域需要在制造T细胞产物过程中定量病毒颗粒的准确方法。简要概述一方面，本公开提出了转导用于免疫疗法的T细胞的方法，包括：(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；(b)用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体激活T细胞；(c)用病毒载体转导活化的T细胞；和(d)扩增转导的T细胞。一方面，T细胞扩增约1天至约20天、约3天至约10天、约4天至约8天或约4天至约6天。一方面，本公开涉及转导用于免疫疗法的T细胞的方法，例如，透过以下方式：(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞；(c)用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞；(d)扩增转导的T细胞；(e)测量在多个体积浓度的病毒载体下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数；(f)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自多个健康供体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及(g)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自患者的T细胞以用于免疫治疗。另一方面，本公开涉及有此需要的患者或个体治疗方法，包括向患者施用以体积浓度用病毒载体转导的T细胞，其中T细胞获自患者，体积浓度由以下确定(a)从多个健康供体获得T细胞，(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。另一方面，本公开涉及以体积浓度病毒载体转导的用于免疫疗法之T细胞，其中T细胞获自患者，体积浓度由以下确定(a)从多个健康供体获得T细胞，(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。另一方面，病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。再一方面，病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。一方面、T细胞扩增约1天至约20天、约2天至约15天、约2天至约12天、约3天至约10天、约本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.权利要求内容为： /n一种转导用于免疫治疗之T细胞的方法，包括/n(a)从至少一个个体中获得T细胞，/n(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞，/n用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，/n(c)扩增转导的T细胞，/n(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，/n(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自至少一个个体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及/n(f)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自至少一个个体的T细胞以用于免疫治疗。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180117 DE 102018100967.4;20180117 US 62/618,2951.权利要求内容为：
一种转导用于免疫治疗之T细胞的方法，包括
(a)从至少一个个体中获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞，
用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增转导的T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自至少一个个体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自至少一个个体的T细胞以用于免疫治疗。


2.权利要求1所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。


3.权利要求1或2所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。


4.权利要求1-3任一项中所述的方法，其中多个体积浓度选自由每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml组成的群。


5.权利要求4所述的方法，其中转导混合物包含细胞浓度为约0.1x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约0.5x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约1.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml。


6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述T细胞获自多个健康个体。


7.权利要求1-6中任一项所述的方法，包括扩增转导的T细胞。


8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中确定在来自至少一个个体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的转导T细胞的体积浓度。


9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中确定在来自至少一个个体的扩增T细胞中产生最大平均拷贝数的整合转基因的体积浓度。


10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中确定的体积浓度为选自由每0.5ml转导混合物含约1μl至约50μl、每0.5ml转导混合物含约5μl至约15μl、和每0.5ml转导混合物含约8μl至约12μl组成的组。


11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中待治疗的个体是癌症患者。


12.权利要求11所述的方法，其中所述癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。


13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中从所述至少一个供体、患者或个体获得的T细胞是CD8+T细胞。


14.一种治疗患者的方法，包括给予患者以体积浓度病毒载体转导的T细胞，
其中T细胞从患者身上获得，
其中体积浓度由以下确定：
(a)从多个健康供体获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。


15.权利要求14所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。


16.权利要求14或15所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。


17.权利要求14-16任一项中所述的方法，其中多个体积浓度选自由每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml组成的群。


18.权利要求17所述的方法，其中转导混合物包含细胞浓度为约0.1x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约0.5x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约1.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml。

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【专利技术属性】
技术研发人员：M·卡拉，A·勃艮第，A·穆罕默德，S·沃尔特，
申请(专利权)人：伊玛提克斯美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US