多特异性配体结合物制造技术

本文提供的尤其是具有多特异结合能力的新的肽组合物，用于治疗和诊断目的。本文提供的肽组合物是多肽缀合物，包括至少2个配体结合域，能够同时靶向(结合)2个或更多个配体(如抗原)。本文提供的肽组合物能以极高收率产生，因而易于生产。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多特异性配体结合物相关申请的交叉引用本申请要求2018年1月5日提交的美国临时申请号62/614,267和2018年9月14日提交的美国临时申请号62/731,781的权益，所述申请通过引用全文纳入本文并用于所有目的。引用“序列表”，表格或以ASCII文件提交的计算机程序列表附件以文件048440-662001WO_Sequence_Listing_ST25形式写成的序列表通过引用纳入本文，其创建于2019年1月7日，254,720字节，IBM-PC机器格式，MSWindows操作系统。专利技术背景出现了免疫治疗，对于许多疾病而言是极具前景的治疗策略。然而，免疫治疗受到明显的安全性和生产问题困扰。不良副作用仍是所有治疗最显著的问题之一，尤其是检查点抑制剂、BiTE和CART细胞。此外，以临床规模(即高收率)生产双特异性分子的困难严重限制了这些有效治疗剂引入临床。本文提供的尤其是这些和本领域其他需求的解决方案。
技术实现思路
一方面，提供肽，包括：(i)第一蛋白二聚化结构域，其经第一化学接头结合第一配体结合域；和(ii)第二蛋白二聚化结构域，其经第二化学接头结合第一配体结合域；其中第一蛋白二聚化结构域能够非共价结合第二蛋白二聚化结构域形成第二配体结合域。一方面，提供肽，包括：(i)第一蛋白二聚化结构域，其经第一化学接头结合第一多价配体结合域；和(ii)第二蛋白二聚化结构域，其经第二化学接头结合第一多价配体结合域；其中第一蛋白二聚化结构域能够非共价结合第二蛋白二聚化结构域形成第二配体结合域。一方面，提供一种分离的核酸，编码本文所述的肽，包括其实施方案。一方面，提供一种表达载体，包括本文所提供的核酸，包括其实施方案。一方面，提供一种药物组合物，包括本文所述的肽(包括其实施方案)以及药学上可接受赋形剂。一方面，提供一种方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的本文所述的肽，包括其实施方案。附图简要说明图1.基于Fab的折叠刀(switchblade)(本文提供肽的实施方案)的卡通图片，空间失活(左侧2张卡通图片)和在肿瘤相关蛋白酶底物切割后有活性(右侧卡通图片)。显示本文所提供的肽，从N末端到C末端包括：抗体重链(第一蛋白二聚化结构域)，第一化学接头，第一配体结合域，第二化学接头和抗体轻链(第二蛋白二聚化结构域)。左侧图代表未切割的肽，而右侧图显示蛋白酶切割切割第一化学接头后的肽。图2.基于Fab的折叠刀的卡通图片，包括Fc结构域，空间失活(左侧卡通图片)和在切割后有活性(右侧卡通图片)。显示本文所提供的肽，从N末端到C末端包括：抗体轻链(第一蛋白二聚化结构域)，第一化学接头，第一配体结合域，第二化学接头和抗体重链(第二蛋白二聚化结构域)。左侧图代表未切割的肽，而右侧图显示蛋白酶切割切割第一化学接头后的肽。底部的灰色箭头指示抗体重链结合Fc区。图3.本文所提供的示范性肽的结构，也称为分子折叠刀。图4.图示传统的双特异性mAb代的示意图。图5.图示申请人的产生双特异性(本文所提供的肽组合物，本文也称为折叠刀或bionic结合物)的新方法的示意图。在该新方法中，表达肽仅需要一条链和一个启动子。图6.示范性代表本文所提供的肽和作用方式。所示的肽包括经第一和第二化学接头连接的第一及第二配体结合域，且2个配体结合域都是组成型有活性的(能结合其各自的配体)且不需要切割化学接头之一就能够结合其各自配体。其在本文也称为“bionics”。或者，所述肽包括可切割接头(第一或第二化学接头)且除非此接头经切割，否则第一配体结合域保持封闭且不结合其各自配体。包括可切割接头和第一配体结合域(所述第一配体结合域是封闭的，除非接头被切割)的肽在本文也称为“折叠刀”。图7.示范性代表本文所提供的肽，包括用于肿瘤结合的纳米抗体选择(如Her2、CD20、TAG72和CEA)。所述肽包括经第一和第二化学接头连接的第一及第二配体结合域，2个配体结合域都是组成型有活性的(能结合其各自的配体)。图7的第一配体结合域是能结合Her2、CD20、TAG72或CEA的纳米抗体，而第二配体结合域是抗CD3Fab或抗CD16Fab。图8.示范性代表本文所提供的肽，包括免疫参与抗体(如T细胞活化剂(例如OX40、GITR、41BB；左侧图)和白介素(右侧图))。所示肽包括经第一和第二化学接头连接的第一及第二配体结合域，2个配体结合域都具有组成型活性(能结合其各自的配体)。图8中的第一配体结合域是T细胞活化剂如OX40、GITR和4-1BB，而第二配体结合域结合肿瘤抗原。图9A-9B.图9A.显示本文所提供的肽的实施方案的卡通图片。图9B.初始亲和层析步骤后材料的SDS-PAGE。产生大量的材料，从而纯化柱立即饱和，防止介质中保留额外材料。图10A-10D.表面等离子体共振描迹线比较纳米抗体与Fab的抗原结合行为。图10A.双特异性(折叠刀)结合Her2。图10B.对照：I83EFab结合Her2。图10C.双特异性(折叠刀)结合CD16a。图10D.抗CD16结合CD16a。图11.差示扫描荧光测定。图显示温度对构建体稳定性的影响且单个组分(αCD16是纳米抗体)。顶部图显示荧光随着温度而变化，底部图显示荧光描迹线的一阶导数随着温度而变化。也参见表1。图12A-12B.图12A.显示本文所提供的肽的实施方案的卡通图片，其中配体结合域是抗CD16单域抗体且第二配体结合域是曲妥单抗Fab。测试接头位置参数。图12B.包括不同接头长度的示范构建体的表达数据。6天时在培养基中超过1mg/ml–样品直接来自上清。在标有星号的样品中，ExpiCHO细胞不健康(即大量细胞死亡)且仍产生相当数量的蛋白。这突出了该平台对产生蛋白的稳健性。图13.显示本文所提供的肽的包括多聚配体结合域的实施方案的卡通图片，所述多聚配体结合域包括抗CD20和抗CD123结构域以及抗CD33Fab(SEQIDNO:2和3)。图14.本文所提供的肽的实施方案的结构。这是简单的模拟实验。显示Fab和生物制剂(纳米抗体；第一配体结合域)的C末端与N末端之间的距离。短肽能用作本文所提供的肽的第一和/或第二接头，接头的长度和组成能改变以空间封闭所插入生物制剂(第一配体结合域)的结合位点。图15A-15C.图15A.由与抗CD16纳米抗体连接的曲妥单抗Fab组成的双特异性抗体(本文所提供的肽的实施方案)激活表达CD16的Jurkat细胞，比赫塞汀(临床曲妥单抗IgG)更有效。激活表明双特异性抗体能够同时结合肿瘤细胞(SKBR3)和表达CD16的Jurkat细胞。图15B.来自图13的三特异性抗体能够结合Raji细胞(CD20阳性)和MV411细胞(CD33和CD123阳性)。显示来自分析型细胞计数的直方图。这里使用2种细胞系：表达CD20的Raji细胞以及表达CD33和CD123的MV411。结合κ链的二抗用于检测三特异性bionic的结合。右移指示结合。这些数据表明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肽，包含：/n(i)第一蛋白二聚化结构域，其经第一化学接头结合第一配体结合域；和/n(ii)第二蛋白二聚化结构域，其经第二化学接头结合所述第一配体结合域；/n其中所述第一蛋白二聚化结构域能够非共价结合所述第二蛋白二聚化结构域形成第二配体结合域。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180105 US 62/614,267;20180914 US 62/731,7811.一种肽，包含：
(i)第一蛋白二聚化结构域，其经第一化学接头结合第一配体结合域；和
(ii)第二蛋白二聚化结构域，其经第二化学接头结合所述第一配体结合域；
其中所述第一蛋白二聚化结构域能够非共价结合所述第二蛋白二聚化结构域形成第二配体结合域。


2.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域不同于所述第二配体结合域。


3.如权利要求1或2所述的肽，其中所述肽还包含连接所述第一蛋白二聚化结构域与所述第二蛋白二聚化结构域的共价键。


4.如权利要求1所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域结合所述第二蛋白二聚化结构域。


5.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头结合所述第一配体结合域的N末端且所述第二化学接头结合所述第一配体结合域的C末端。


6.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头结合所述第一配体结合域的C末端且所述第二化学接头结合所述第一配体结合域的N末端。


7.如权利要求1所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域包含可变轻链结构域。


8.如权利要求1所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域包含恒定轻链结构域。


9.如权利要求8所述的肽，其中所述可变轻链结构域经所述恒定轻链结构域结合所述第一配体结合域。


10.如权利要求1所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域是抗体轻链。


11.如权利要求1所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域包含可变重链结构域。


12.如权利要求1所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域包含恒定重链结构域。


13.如权利要求12所述的肽，其中所述恒定重链结构域经所述可变重链结构域结合所述第一配体结合域。


14.如权利要求1所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域是抗体重链。


15.如权利要求1所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域包含可变重链结构域。


16.如权利要求15所述的肽，其中所述第一蛋白二聚化结构域包括恒定重链结构域。


17.如权利要求16所述的肽，其中所述可变重链结构域经所述恒定重链结构域结合所述第一配体结合域。


18.如权利要求15所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域包含可变轻链结构域。


19.如权利要求15所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域包含恒定轻链结构域。


20.如权利要求19所述的肽，其中所述恒定轻链结构域经所述可变轻链结构域结合所述第一配体结合域。


21.如权利要求15所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域是抗体轻链。


22.如权利要求1所述的肽，其中所述第二配体结合域是Fab结构域。


23.如权利要求1所述的肽，其中所述第二蛋白二聚化结构域经第三化学接头结合Fc结构域。


24.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头是肽基接头。


25.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头还包含第三配体结合域。


26.如权利要求25所述的肽，其中所述第三配体结合域经第四化学接头结合所述第一配体结合域。


27.如权利要求1所述的肽，其中所述第二化学接头是肽基接头。


28.如权利要求1所述的肽，其中所述第二化学接头还包含第四配体结合域。


29.如权利要求28所述的肽，其中所述第四配体结合域经第五化学接头结合所述第一配体结合域。


30.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域、所述第二配体结合域、所述第三配体结合域和所述第四配体结合域独立地不同或相同。


31.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域、所述第二配体结合域、所述第三配体结合域和所述第四配体结合域独立地是肿瘤结合域、T细胞活化域或白介素结构域。


32.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域、所述第二配体结合域、所述第三配体结合域和所述第四配体结合域独立地包含CD3结合域、CD16结合域、Her2结合域、CD123结合域、CD20结合域、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)结合域、癌胚抗原(CEA)结合域、CD252结合域、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)结合域或41BB结合域。


33.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域、所述第三配体结合域和所述第四配体结合域独立地包含单域抗体结构域。


34.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头和所述第二化学接头独立地是共价接头或非共价接头。


35.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头和所述第二化学接头独立地是可切割的肽接头。


36.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头和所述第二化学接头独立地是酶可切割的接头。


37.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头和所述第二化学接头独立地是蛋白酶可切割的接头。


38.如权利要求1所述的肽，其中所述第一化学接头和所述第二化学接头独立地具有约0-约15个氨基酸残基的长度。


39.如权利要求1所述的肽，其中所述第一配体结合域是第一Fc二聚化结构域。


40.如权利要求39所述的肽，其中所述第一Fc二聚化结构域结合第二肽，所述第二肽包含：
(i)第三蛋白二聚化结构域，其经第四化学接头结合第二Fc二聚化结构域；和
(ii)第四蛋白二聚化结构域，其经第五化学接头结合所述第二Fc二聚化结构域；
其中所述第三蛋白二聚化结构域能够非共价结合所述第四蛋白二聚化结构域形成第三配体结合域；和
其中所述第一Fc二聚化结构域和所述第二Fc二聚化结构域共价结合在...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·威廉斯，J·金，
申请(专利权)人：希望之城，
类型：发明
国别省市：美国;US