【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CAR-T细胞的封闭系统制造过程相关的申请本申请要求2018年2月6日提交的名称为“CAR-T细胞的封闭系统制造过程”的美国临时申请No.62/627,129的优先权,以引用的方式将其整体明确地并入本文。
本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中,以单个无血清体积(singleserum-freevolume)培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中,用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞,并且与常规方法相比,在更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。
技术介绍
细胞的基因修饰已用于许多领域,例如研究、医学、工业生物技术和农业。存在多种用于将基因插入宿主基因组中的可用技术。例如,可通过细胞的核被膜而将核酸直接注射到细胞核中,或使用病毒载体将核酸给予至细胞以产生基因修饰细胞。用病毒载体进行的转染是在称为病毒转导的技术中产生基因修饰细胞(例如T细胞)的常用技术。使用诸如慢病毒或腺病毒的病毒作为载体将核酸引入细胞。病毒转导可用于使用质粒在细胞(例如哺乳动物细胞)中插入或修饰基因。病毒转导中使用的质粒包含侧翼为病毒序列的待转移的基因,所述病毒序列被病毒蛋白质用来识别病毒基因组并将其包装成病毒颗粒。该质粒与可能携带形成感染性病毒粒子所需的病毒基因的其他DNA构建体一起插入细胞。由这些包装构建体表达的病毒蛋白可结合待转移并插入病毒颗粒中的DNA/RNA上的序列。通常,出于安全原因,所使用的质粒均不包含病毒形成所需的所有序列,因此需要同时转染 ...
【技术保护点】
1.一种制造基因修饰T细胞的方法,其中,所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体,所述方法包括:/n在单个培养容器中的第一培养基中提供CD8
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180206 US 62/627,1291.一种制造基因修饰T细胞的方法,其中,所述基因修饰T细胞包含嵌合抗原受体,所述方法包括:
在单个培养容器中的第一培养基中提供CD8+T细胞和CD4+T细胞;
将第二培养基放入所述单个培养容器中,从而产生共培养的CD4+T细胞和CD8+T细胞,对所述细胞进行起始处理以用于转导;
收获经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞;以及
用载体转导所述经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞,从而产生基因修饰T细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述方法在生物安全柜(BSC)中进行。
3.如权利要求1所述的方法,其中,所述方法在生物安全柜(BSC)的外部进行。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,所述载体为病毒载体。
5.如权利要求4所述的方法,其中,所述载体为慢病毒载体、腺相关载体或腺病毒载体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,通过如下进行所述转导:例如在CTSDynabeadsCD3/CD28上磁性地富集所述经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞,以及将转导混合物与所述经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞一起孵育确定的时间段。
7.如权利要求6所述的方法,其中,在将转导介质添加至所述细胞之前,从所述培养容器中移去所述培养基。
8.如权利要求6或7所述的方法,其中,所述确定的时间段处于约1小时至约24小时、约2小时至约12小时或约2小时至约5小时的范围内。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法,其中,在所述确定的时间段结束时,将移去的所述培养基重新引入所述容器中。
10.如权利要求6-9中任一项所述的方法,其中,所述转导混合物包含所述载体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中,所述第一培养基为无细胞因子的培养基或者缺少胎牛血清或小牛血清、或其任意组合。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中,所述第二培养基包含至少一种细胞因子。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述至少一种细胞因子为IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
14.如权利要求13所述的方法,其中,所述至少一种细胞因子为IL-21、IL-15和IL-7。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中,所述转导步骤在所述经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细胞的收获步骤之后24小时进行。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中,所述第一培养基和/或第二培养基还包含蛋白补充剂。
17.如权利要求6-16中任一项所述的方法,其中,所述转导混合物进一步包含硫酸鱼精蛋白或聚凝胺或两者。
18.如权利要求6-17中任一项所述的方法,其中,所述转导混合物进一步包含白介素。
19.如权利要求18所述的方法,其中,所述转导混合物包含IL-2、IL-21、IL-15或IL-7或其任意组合。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法,其中,在所述转导步骤后3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或由上述任意两个时间段定义的范围内的任意天数收获基因修饰CD4+T细胞和CD8+T细胞。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中,所述载体包含编码用于治疗的蛋白的核酸。
22.如权利要求21所述的方法,其中,所述用于治疗的蛋白包括细胞因子、嵌合细胞因子/共刺激蛋白、或者促炎蛋白或抗炎蛋白或其任意组合。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法,其中,所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中,进一步用核酸酶修饰所述经起始处理的CD4+T细胞和CD8+T细...
【专利技术属性】
技术研发人员:迈克尔·C·延森,约书亚·古斯塔夫松,
申请(专利权)人:西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所,
类型:发明
国别省市:美国;US
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