公开了用于产生天然杀伤细胞的方法。方法包括从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种；和在细胞因子存在的情况下将CD56+细胞和/或CD3‑/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养。还公开了用于治疗癌症的组合物。组合物包括由公开的方法产生的CD56+天然杀伤细胞和细胞因子。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的组合物通过引用并入任何优先权申请该申请要求2018年2月1日提交的韩国专利申请号KR-10-2018-0012938、2018年2月1日提交的韩国专利申请号KR-10-2018-0012942、2019年1月7日提交的韩国专利申请号KR-10-2019-0001981和2019年1月7日提交的韩国专利申请号KR-10-2019-0001983的权益，其公开内容通过引用以其全部并入本文。背景领域本公开内容涉及用于高纯度天然杀伤细胞的制造方法。相关领域的描述人体通过由免疫系统协调的免疫应答被保护免受病原体影响，所述免疫系统包括许多免疫相关的细胞、化学介质(chemicalmediator)如细胞因子等。白细胞，尤其是淋巴细胞，在这种免疫系统中起着重要的作用。淋巴细胞涉及先天和后天免疫。天然杀伤细胞(NK细胞)是一类先天免疫细胞，其已知非特异性杀伤癌症，识别和杀伤病毒、细菌等，并且用酶如穿孔素和颗粒酶或通过Fas-FasL相互作用杀伤病原体。在癌症患者的情况中，已经报道这些NK细胞的癌细胞细胞毒性的降低与各种类型的癌症的发作有关，如肺癌(CarregaP等，Cancer，2008:112:863-875)、肝癌(JinushiM等，JHepatol.，2005:43；1013-1020)、乳腺癌(BauernhoferT等，EurJImmunol.，2003:33:119-124)、子宫癌(MocchegianiE.等，BrjCancer.，1999:79:244-250)、血液癌(TajimaF.等，Lekemia1996:10:478-482)等。因此，对于癌症疗法，期望增加NK细胞的癌细胞细胞毒性。为了获得癌细胞的NK-介导的杀伤的治疗效果，需要大量具有高纯度的NK细胞，但是从癌症患者获得大量血液并不容易，并且血液中NK细胞的比例很小，仅为约5％至20％。因此，很难使用NK细胞作为免疫治疗剂。因此，期望仅NK细胞有效地扩增和增殖，但是在NK细胞增殖的常规方法中，需要以高浓度使用各种昂贵的细胞因子，因此相应的疗法仅可用于一些财务稳定的患者。此外，根据NK细胞增殖的常规方法，其他类型的免疫细胞(例如，T细胞、B细胞等)可以与NK细胞一起存在，并且包含T细胞的NK细胞的同种异体施用可引起移植物抗宿主病(GVHD)，并且将包含B细胞的NK细胞的同种异体施用给对血型不相容的受试者可导致过客B-淋巴细胞综合征，因此抗癌效果没有最大化。此外，除了扩增和增殖NK细胞，期望高度维持NK细胞的功能，直到实际地使用扩增和增殖的NK细胞。因此，寻求开发这样的组合物，其能够促进NK细胞的增殖，增加衍生自NK细胞的细胞因子如TNF-、INF-和GM-CSF的产生和增加NK细胞的癌细胞细胞毒性。概要本申请涉及产生高纯度天然杀伤细胞的方法和用于治疗癌症的细胞治疗组合物，其包括高纯度天然杀伤细胞和细胞因子。本文公开的任何特征、结构或步骤可用本文公开的或省略的任何其他特征、结构或步骤替代或与其组合。此外，为了总结公开内容的目的，本文已经描述了专利技术的某些方面、优点和特征。应当理解，依照本文公开的专利技术的任何具体的实施方式，不一定实现任何或所有这种优点。该公开内容的各个方面都不是必不可少的或绝对必要的。在一个实施方式中，公开了产生天然杀伤细胞的方法。方法包括：从血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)；从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和在细胞因子存在的情况下将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养。在某些实施方式中，从PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种通过使用CD56微珠和CD3微珠中的至少一种进行。在某些实施方式中，细胞因子选自由IL-2、IL-21、IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF1及其组合组成的组。在某些实施方式中，细胞因子可以以50-1000IU/mL的浓度添加。在某些实施方式中，饲养细胞的组合包括辐照的Jurkat细胞和辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞。在一个变型中，辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞的比例可为约1:0.1-5。辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞各自可通过50-500Gy的辐照获得。在某些实施方式中，共培养可包括共培养1-50天。在某些实施方式中，方法可进一步包括在第一细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第一周期；并且随后在第二细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第二周期。在一个变型中，在第二周期的第0-6天期间，第二细胞因子可添加一次或多次。在第二周期期间，在每个十四天循环的前六天期间，第二细胞因子可添加一次或多次。第一细胞因子可以为IL-2。第二细胞因子可以为IL-21。第二细胞因子可以以10-100ng/mL的浓度添加。在某些实施方式中，CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种和饲养细胞的组合以CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞与饲养细胞的约1:1-100的比例共培养。在某些实施方式中，公开了由该方法制造的组合物。在一个实施方式中，公开了用于在需要其的患者中治疗癌症的组合物。组合物包括：有效量的衍生自外周血的CD56+天然杀伤细胞，其中有效量在每kg患者体重约1×106至5×108个细胞的范围内，并且其中CD56+天然杀伤细胞为至少约90％纯度；具有50-50,000IU/mL浓度的IL-2；和药学上可接受的载体。在某些实施方式中，细胞因子可选自由IL-2、IL-21、IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF1及其组合组成的组。在一个变型中，细胞因子可以为IL-2。细胞因子可具有50-50,000IU/mL的浓度。在某些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：血液癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、前列腺癌和神经母细胞瘤。在某些实施方式中，组合物包括小于约1％的T细胞。附图说明为了示例性的目的，在附图中描绘了各种实施方式，并且决不应该被解释为限制实施方式的范围。此外，不同公开的实施方式的各种特征可被组合以形成另外的实施方式，其是该公开内容的部分。图1A图示了示出由PBMC、CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞产生的NK细胞的细胞生长速率的图。图1B图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情况下由PBMC和CD56+细胞产生的NK细胞的细胞生长速率的图。图2图示了示出在用IL-21处理的情况下或在不用IL-21处理的情本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产生天然杀伤细胞的方法，其包括：/n从血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)；/n从所述PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和/n在细胞因子存在的情况下，共培养CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180201 KR 10-2018-0012938;20180201 KR 10-2018-001.一种产生天然杀伤细胞的方法，其包括：
从血液样品分离外周血单核细胞(PBMC)；
从所述PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种；和
在细胞因子存在的情况下，共培养CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中从所述PBMC中分离CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种通过使用CD56微珠和CD3微珠中的至少一种进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞因子选自由IL-2、IL-21、IL-15、Flt3-L、SCF、IL-7、IL-18、IL-4、I型干扰素、GM-CSF、IGF1及其组合组成的组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞因子以50-1000IU/mL浓度添加。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞的组合包括辐照的Jurkat细胞和辐照的Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞连续系(EBV-LCL)细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中辐照的Jurkat细胞和辐照的EBV-LCL细胞的比例为约1:0.1-5或0.1-5:1。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述辐照的Jurkat细胞和所述辐照的EBV-LCL细胞各自通过50-500Gy的辐照获得。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述共培养包括共培养1-50天。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其进一步包括：
在第一细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第一周期；和
随后在第二细胞因子存在的情况下，将CD56+细胞和/或CD3-/CD56+细胞中的至少一种与饲养细胞的组合共培养第二周期。
10.根据权利要求9所述的方法，其中在第二周期的第0-6天期间添加所述第二细...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴商佑，金容萬，丁在燮，李龍姬，
申请(专利权)人：NKMAX有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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