【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原代细胞基因编辑相关申请的交叉引用本申请要求于2017年10月30日提交的美国临时申请第62/579,113号和于2017年10月30日提交的美国临时申请第62/579,114号的权益，这些申请中的每一个出于所有目的特此通过引用以其整体并入。序列表本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS-Web提交，并且该序列表通过引用以其整体并入本文。于20XX年月XX日生成的所述ASCII副本被命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt并且大小为X,XXX,XXX字节。背景基因靶向是一种通过其可以直接编辑基因组的方法，为工程化细胞产品、修复引起遗传疾病的突变或创造突变来研究基因提供了途径。基因靶向依赖于在携带所期望的改变的序列的同源修复模板DNA连同靶向感兴趣基因座的位点特异性核酸酶一起的递送后的同源重组。基因靶向已被用于人类原代T细胞，以产生具有新颖特异性的T细胞。在这些情况下，已经使用AAV递送同源修复模板DNA。该DNA包含对新表位特异性的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的编码序列。当这些序列被靶向TCRα基因座(通常)或TCRβ基因座时，研究人员可以实现内源TCR的同时敲除(并去除对应的特异性)，以及新蛋白(和对应的特异性)的敲入。这一过程用于规模化产生用于治疗用途的CART细胞和TCRT细胞。然而，AAV产生需要大量的时间，成本高，难度大，而且监管严格，限制了其应用。先前已经描述了用裸质粒DNA进行基因编辑，但是仅在永生化细胞系的背景下，提出原代细胞中的毒性问题。这些...
【技术保护点】
1.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含：/n包含外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：/na)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；/nb)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和/nc)与所述内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，/n与所述内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源基因组靶基因座处的同源重组，并且/n其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171030 US 62/579,114;20171030 US 62/579,1131.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含：
包含外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：
a)编码基因的至少一部分的核苷酸序列；
b)与内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和
c)与所述内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，
与所述内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源基因组靶基因座处的同源重组，并且
其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。
2.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含T细胞，所述T细胞包含：
a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；
b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；
c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；
d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；
其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR-α基因座中，
所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得所述多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中所述第二接头多肽序列位于所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列之间，
所述第一接头多肽和所述第二接头多肽是能够在所述T细胞中被裂解使得所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中所述单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR，
其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分，并且
其中内源TCR-β基因座被破坏。
3.根据权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含整合的核苷酸序列，其中所述整合的核苷酸序列包含与所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，所述整合的核苷酸序列被整合在所述内源基因组靶基因座处，并且所述整合的核苷酸序列被取向为使得所述基因的至少一部分能够被表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含能够裂解所述内源基因组靶基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。
5.一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含T细胞，所述T细胞包含：
a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；
b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；
c)编码第一接头多肽序列的核苷酸序列；
d)编码第二接头多肽序列的核苷酸序列；
其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被整合到内源TCR基因座中，
所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列以及所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列被取向为使得所述多肽序列的每一个能够被表达为单一多肽，其中所述第二接头多肽序列位于所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列之间，并且
所述第一接头多肽和所述第二接头多肽是能够在所述T细胞中被裂解使得所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列各自形成单独的多肽的可裂解接头多肽，其中所述单独的多肽能够缔合在一起形成功能性TCR。
6.根据权利要求5所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：
a)编码以下的核苷酸序列：编码TCR-α多肽序列的所述核苷酸序列、编码TCR-β多肽序列的所述核苷酸序列以及编码第一接头多肽序列的所述核苷酸序列和编码第二接头多肽序列的所述核苷酸序列；
b)与所述内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和
c)与所述内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且
与所述内源TCR基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源TCR基因座处的同源重组。
7.根据权利要求5或6所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞基本上不含病毒介导的递送组分。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含能够裂解所述内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。
10.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中产生所述无功能基因的突变包括在所述基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。
11.根据权利要求9所述的修饰的细胞，其中产生所述无功能基因的突变包括在所述基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由所述基因编码的mRNA产物的表达的突变以及改变由所述基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含能够裂解所述修饰的细胞内的所述第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物。
13.根据权利要求4或权利要求8-12中任一项所述的修饰的细胞，其中所述核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶或其衍生物、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。
14.根据权利要求13所述的修饰的细胞，其中所述CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。
15.根据权利要求4或权利要求8-14中任一项所述的修饰的细胞，其中所述核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。
16.根据权利要求4或权利要求8-14中任一项所述的修饰的细胞，其中所述核酸酶组合物包含能够在所述修饰的细胞内表达所述核酸酶的核苷酸载体。
17.根据权利要求4或权利要求8-16中任一项所述的修饰的细胞，其中所述核酸酶组合物包含CRISPRRNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)。
18.根据权利要求17所述的修饰的细胞，其中所述crRNA包含指导RNA(gRNA)，其中所述gRNA与所述指定的核苷酸序列互补。
19.根据权利要求18所述的修饰的细胞，其中所述crRNA和所述tracrRNA在单一多核苷酸上。
20.根据权利要求18所述的修饰的细胞，其中所述crRNA和所述tracrRNA在分开的多核苷酸上。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的修饰的细胞，其中所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列或被编码的多肽序列的表达由所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座内的内源启动子指导。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的修饰的细胞，其中所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列或被编码的多肽序列的表达由外源启动子指导。
23.根据权利要求22所述的修饰的细胞，其中所述外源启动子选自由以下组成的组：哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体、MMLVLTR启动子、HIVLTR启动子、MCMVLTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的修饰的细胞，其中所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列、所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列或所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的修饰的细胞，其中所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列、所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列或所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的修饰的细胞，其中与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的修饰的细胞，其中与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。
28.根据权利要求1-25中任一项所述的修饰的细胞，其中与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座的第一区域相同的核苷酸序列和与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座的第二区域相同的核苷酸序列各自长度大于或等于600个碱基。
29.根据权利要求4或权利要求8-28中任一项所述的修饰的细胞，其中在所述核苷酸序列的整合后，所述指定的核苷酸序列被破坏。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的修饰的细胞，其中与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座可操作地缔合的内源基因的表达被破坏。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的修饰的细胞，所述修饰的细胞还包含能够增加同源重组率的另外的试剂。
32.根据权利要求31所述的修饰的细胞，其中能够增加同源重组率的另外的试剂包括同源重组修复途径的激活剂、非同源末端连接(NHEJ)修复途径的抑制剂或其组合。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的修饰的细胞，所述修饰的细胞还包含能够增加所述修饰的细胞的存活力的另外的试剂。
34.根据权利要求33所述的修饰的细胞，其中能够增加所述修饰的细胞的存活力的另外的试剂包括核酸感知途径的抑制剂。
35.根据权利要求34所述的修饰的细胞，其中所述核酸感知途径包括选自以下的组：TLR9核酸感知途径、AIM2核酸感知途径、IFI16核酸感知途径、cGAS核酸感知途径和胞质核酸感知途径。
36.根据权利要求34所述的修饰的细胞，其中所述核酸感知途径的抑制剂包括寡核苷酸拮抗剂。
37.根据权利要求36所述的修饰的细胞，其中所述寡核苷酸拮抗剂包含序列TTAGGG或其串联重复序列。
38.根据权利要求1-4中任一项或权利要求6-33中任一项所述的修饰的细胞，其中所述环状多核苷酸包括质粒或纳米质粒。
39.根据权利要求38所述的修饰的细胞，其中所述质粒具有少于500个碱基的载体骨架，并且其中所述载体骨架为不是所述编码基因的至少一部分的核苷酸序列、不是所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、不是所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、不是编码所述第一接头多肽和所述第二接头多肽的核苷酸序列、不是与第一内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列并且不是与第二内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列的核苷酸序列。
40.根据权利要求1-4中任一项或权利要求6-39中任一项所述的修饰的细胞，其中所述环状多核苷酸不是聚合酶链式反应(PCR)扩增的多核苷酸。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的修饰的细胞，其中所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座包含编码区。
42.根据权利要求1-40中任一项所述的修饰的细胞，其中所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座包含内含子。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的修饰的细胞，其中所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座包括T细胞受体(TCR)-α基因座。
44.根据权利要求43所述的修饰的细胞，其中由所述第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-β基因。
45.根据权利要求1-42中任一项所述的修饰的细胞，其中所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座包括TCR-β基因座。
46.根据权利要求45所述的修饰的细胞，其中由所述第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-α基因。
47.根据权利要求1-4中任一项或权利要求9-42中任一项所述的修饰的细胞，其中所述内源基因组靶包括免疫检查点基因座。
48.根据权利要求47所述的修饰的细胞，其中所述免疫检查点基因座选自由以下组成的组：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA。
49.根据权利要求1-4中任一项或权利要求9-48中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分包含接头序列。
50.根据权利要求49所述的修饰的细胞，其中所述接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，所述可裂解接头多肽被裂解，使得仅由所述基因的至少一部分编码的多肽被产生。
51.根据权利要求50所述的修饰的细胞，其中所述可裂解接头多肽中的任一个包含弗林蛋白酶裂解位点。
52.根据权利要求5-51中任一项所述的修饰的细胞，其中所述接头序列中的任一个包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。
53.根据权利要求5-52中任一项所述的修饰的细胞，其中所述可裂解接头多肽中的任一个包含Gly-Ser-Gly接头，任选地其中所述Gly-Ser-Gly接头是2A核糖体跳跃元件的N末端，并且任选地其中所述Gly-Ser-Gly接头呈从N末端至C末端的弗林蛋白酶裂解位点:Gly-Ser-Gly接头:2A核糖体跳跃元件取向。
54.根据权利要求49所述的修饰的细胞，其中所述接头序列、所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。
55.根据权利要求49所述的修饰的细胞，其中所述接头序列、所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含外源启动子。
56.根据权利要求5-55中任一项所述的修饰的细胞，其中所述接头序列、所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列或所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含剪接受体序列。
57.根据权利要求5-56中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分、所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含编码信号肽的核苷酸序列，其中所述信号肽被可操作地连接至由所述基因的至少一部分编码的多肽、所述TCR-α多肽序列、所述TCR-β多肽序列或由所述TCR基因的至少一部分编码的多肽。
58.根据权利要求57所述的修饰的细胞，其中所述信号肽是外源信号肽，任选地，其中所述外源信号肽是人类生长激素信号肽。
59.根据权利要求5-58中任一项所述的修饰的细胞，其中所述第一接头多肽序列和所述第二接头多肽序列包含相同的接头多肽序列。
60.根据权利要求59所述的修饰的细胞，其中编码相同的接头多肽序列的所述编码第一接头多肽序列的核苷酸序列和所述编码第二接头多肽序列的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中编码第一接头多肽序列的所述核苷酸序列和编码第二接头多肽的所述核苷酸序列相对于彼此是密码子趋异的。
61.根据权利要求1-4中任一项或权利要求9-56中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分编码编码区。
62.根据权利要求61所述的修饰的细胞，其中所述编码区选自由以下组成的组：调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子和免疫检查点抑制剂。
63.根据权利要求1-4中任一项或权利要求9-56中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分编码非编码区。
64.根据权利要求63所述的修饰的细胞，其中所述非编码区选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子和促进T细胞功能的因子。
65.根据权利要求1-4中任一项或权利要求9-56中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。
66.根据权利要求65所述的修饰的细胞，其中所述TCR基因的至少一部分包含：
a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；
b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和
c)编码第二接头序列的核苷酸序列。
67.根据权利要求5-66中任一项所述的修饰的细胞，其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。
68.根据权利要求5-67中任一项所述的修饰的细胞，其中所述TCR-α多肽序列、所述TCR-β多肽序列或由TCR基因的至少一部分编码的多肽被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与第二外源TCR多肽序列更大程度的缔合，任选地，其中所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与彼此更大程度的缔合。
69.根据权利要求5-68中任一项所述的修饰的细胞，其中被编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头:TCR-α:第二接头:TCR-β取向。
70.根据权利要求5-68中任一项所述的修饰的细胞，其中被编码的多肽序列呈从N末端至C末端的接头:TCR-β:第二接头:TCR-α取向。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的修饰的细胞，其中所述基因的至少一部分、所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中所述密码子趋异的核苷酸序列相对于内源核苷酸序列是密码子趋异的。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包括免疫细胞。
73.根据权利要求72所述的修饰的细胞，其中所述免疫细胞包括T细胞。
74.根据权利要求73所述的修饰的细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、肿瘤浸润性T细胞、工程化T细胞、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、α-βT细胞和γ-δT细胞。
75.根据权利要求72所述的修饰的细胞，其中所述免疫细胞包括自然杀伤细胞。
76.根据权利要求72所述的修饰的细胞，其中所述免疫细胞选自由以下组成的组：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤T细胞。
77.根据权利要求1-71中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包括干细胞。
78.根据权利要求78所述的修饰的细胞，其中所述干细胞包括造血干细胞。
79.根据权利要求78所述的修饰的细胞，其中所述干细胞包括胚胎干细胞。
80.根据权利要求1-79中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是原代细胞。
81.根据权利要求1-81中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是分离的细胞，其中所述分离的细胞是从受试者分离的。
82.根据权利要求81所述的修饰的细胞，其中所述受试者已知或疑似患有癌症。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包括人类细胞或人类来源的细胞。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞是离体培养的细胞。
85.根据权利要求84所述的修饰的细胞，其中所述离体培养的细胞包括经刺激的细胞。
86.根据权利要求85所述的修饰的细胞，其中所述经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中所述细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。
87.根据权利要求86所述的修饰的细胞，其中所述细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。
88.根据权利要求86或87所述的修饰的细胞，其中所述细胞因子刺激的T细胞是在IL2的存在下培养的。
89.根据权利要求86或87所述的修饰的细胞，其中所述细胞因子刺激的T细胞是在基本上不含IL2的培养基中培养的。
90.根据权利要求1-89中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞不含整合的病毒，其中所述整合的病毒与所述病毒介导的递送组分可操作地缔合。
91.根据权利要求1-89中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞的表面上的MHCI类不含来源于病毒介导的递送组分或整合的病毒的肽，其中所述整合的病毒与所述病毒介导的递送组分可操作地缔合。
92.根据权利要求1-89中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含第二环状多核苷酸，所述第二环状多核苷酸包含第二外源核苷酸组合物，所述第二外源核苷酸组合物包含：
a)编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列；
b)与第二内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和
c)与所述第二内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且
与所述第二内源基因组靶基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述第二内源基因组靶基因座处的同源重组。
93.根据权利要求92所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞还包含第二整合的核苷酸序列，其中所述第二整合的核苷酸序列包含与所述编码第二基因的至少一部分的核苷酸序列相同的序列，所述第二整合的核苷酸序列被整合在所述第二内源基因组靶基因座处，并且所述第二整合的核苷酸序列被取向为使得所述第二基因的至少一部分能够被表达。
94.一种细胞群体，所述细胞群体包含根据权利要求3-93中任一项所述的修饰的细胞，其中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％的所述群体包含所述整合的核苷酸序列。
95.根据权利要求94所述的细胞群体，其中所述修饰的细胞在所述整合的核苷酸序列的整合后没有经历分选、选择或分离。
96.一种细胞群体，所述细胞群体包含：
整合的核苷酸序列，
其中所述整合的核苷酸序列包含基因的至少一部分，所述整合的核苷酸序列被整合在内源基因组靶基因座处，并且所述整合的核苷酸序列被取向为使得所述基因的至少一部分能够被表达，
其中所述细胞群体基本上不含病毒介导的递送组分，并且
其中所述群体中大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％的T细胞包含所述整合的核苷酸序列。
97.根据权利要求96所述的细胞群体，其中所述T细胞在所述整合的核苷酸序列的整合后没有经历分选、选择或分离。
98.根据权利要求96或97所述的细胞群体，其中所述细胞群体还包含能够裂解内源TCR基因座内的指定的核苷酸序列的核酸酶组合物。
99.根据权利要求96-98中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体还包含含有外源核苷酸序列的环状多核苷酸，所述外源核苷酸序列包含：
a)编码所述基因的至少一部分的核苷酸序列；
b)与所述内源基因座的第一区域相同的核苷酸序列；和
c)与内源基因座的第二区域相同的核苷酸序列，并且
与所述内源基因座的第一区域和第二区域相同的核苷酸序列被取向为促进所述内源基因座处的同源重组。
100.根据权利要求96-99中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是至少1×106个T细胞、至少2×106个T细胞、至少5×106个T细胞、至少1×107个T细胞或至少5×107个T细胞。
101.根据权利要求96-100中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体还包含突变，所述突变产生由第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因。
102.根据权利要求101所述的细胞群体，其中产生所述无功能基因的突变包括在所述基因的编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：导致被翻译的蛋白的读框改变的移码突变、引起氨基酸被终止密码子取代的无义突变以及导致一种氨基酸被另一种氨基酸取代的错义突变。
103.根据权利要求101所述的细胞群体，其中产生所述无功能基因的突变包括在所述基因的非编码区中的突变，所述突变选自由以下组成的组：改变由所述基因编码的mRNA产物的表达的突变以及改变由所述基因编码的mRNA产物的稳定性的突变。
104.根据权利要求101-103中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体还包含能够裂解所述细胞群体内的所述第二指定的核苷酸序列的第二核酸酶组合物。
105.根据权利要求98-104中任一项所述的细胞群体，其中所述核酸酶组合物包含选自由以下组成的组的核酸酶：成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)家族核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或其衍生物、锌指核酸酶(ZFN)或其衍生物以及归巢内切核酸酶(HE)或其衍生物。
106.根据权利要求105所述的细胞群体，其中所述CRISPR家族核酸酶是Cas9核酸酶。
107.根据权利要求98-106中任一项所述的细胞群体，其中所述核酸酶组合物包含预先形成的蛋白复合体。
108.根据权利要求98-106中任一项所述的细胞群体，其中所述核酸酶组合物包含能够在所述细胞群体内表达所述核酸酶的核苷酸载体。
109.根据权利要求98-108中任一项所述的细胞群体，其中所述核酸酶组合物包含指导RNA，所述指导RNA在所述指定的核苷酸序列处指导核酸酶介导的裂解。
110.根据权利要求109所述的细胞群体，其中所述指导RNA包含CRISPRRNA(crRNA)和反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)。
111.根据权利要求110所述的细胞群体，其中所述crRNA和所述tracrRNA在单一多核苷酸上。
112.根据权利要求110所述的细胞群体，其中所述crRNA和所述tracrRNA在分开的多核苷酸上。
113.根据权利要求96-112中任一项所述的细胞群体，其中被编码的多肽序列的表达由所述内源基因组靶基因座内的内源启动子指导。
114.根据权利要求96-112中任一项所述的细胞群体，其中被编码的多肽序列的表达由外源启动子指导。
115.根据权利要求114所述的细胞群体，其中所述外源启动子选自由以下组成的组：哺乳动物启动子、人类启动子、病毒启动子、来自逆转录病毒或慢病毒的长末端重复序列(LTR)来源启动子、两个启动子的融合体、两个启动子部分的融合体、MMLVLTR启动子、HIVLTR启动子、MCMVLTR启动子、EF1a启动子、MND启动子、CMV启动子、SV40启动子、PGK1启动子、Ubc启动子、β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、小分子诱导型启动子、四环素诱导型启动子、小分子条件性启动子、Cre-LoxP条件性启动子系统、Flp-FRT条件性启动子系统和他莫昔芬条件性启动子系统。
116.根据权利要求96-115中任一项所述的细胞群体，其中编码所述基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于100个碱基。
117.根据权利要求96-115中任一项所述的细胞群体，其中编码所述基因的至少一部分的核苷酸序列的长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于400个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于800个碱基、长度大于或等于1500个碱基、长度大于或等于2000个碱基或者长度大于或等于4000个碱基。
118.根据权利要求99-117中任一项所述的细胞群体，其中与所述内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。
119.根据权利要求99-118中任一项所述的细胞群体，其中与所述内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列的长度大于或等于50个碱基、长度大于或等于100个碱基、长度大于或等于200个碱基、长度大于或等于300个碱基、长度大于或等于600个碱基、长度大于或等于1000个碱基或者长度大于或等于2000个碱基。
120.根据权利要求99-119中任一项所述的细胞群体，其中与所述内源基因组靶基因座的第一区域相同的核苷酸序列和与所述内源基因组靶基因座的第二区域相同的核苷酸序列各自长度大于或等于600个碱基。
121.根据权利要求98-120中任一项所述的细胞群体，其中在所述核苷酸序列的整合后，所述指定的核苷酸序列被破坏。
122.根据权利要求96-121中任一项所述的细胞群体，其中与所述内源基因组靶基因座或所述内源TCR基因座可操作地缔合的内源基因的表达被破坏。
123.根据权利要求96-122中任一项所述的细胞群体，所述细胞群体还包含能够增加同源重组率的另外的试剂。
124.根据权利要求96-123中任一项所述的细胞群体，所述细胞群体还包含能够增加所述细胞群体的存活力的另外的试剂。
125.根据权利要求99-124中任一项所述的细胞群体，其中所述环状多核苷酸包括质粒或纳米质粒。
126.根据权利要求125所述的细胞群体，其中所述质粒具有少于500个碱基的载体骨架，并且其中所述载体骨架为不是编码所述基因的至少一部分的核苷酸序列、不是编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、不是编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列、不是编码第一接头多肽和第二接头多肽的核苷酸序列、不是与第一内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列并且不是与第二内源靶基因组基因座或内源TCR基因座相同的核苷酸序列的核苷酸序列。
127.根据权利要求99-126中任一项所述的细胞群体，其中所述环状多核苷酸不是聚合酶链式反应(PCR)扩增的多核苷酸。
128.根据权利要求96-127中任一项所述的细胞群体，其中所述内源基因组靶基因座包含编码区。
129.根据权利要求96-127中任一项所述的细胞群体，其中所述内源基因组靶基因座包含内含子。
130.根据权利要求96-129中任一项所述的细胞群体，其中所述内源基因组靶基因座包括T细胞受体(TCR)-α基因座。
131.根据权利要求130所述的细胞群体，其中由所述第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-β基因。
132.根据权利要求96-129中任一项所述的细胞群体，其中所述内源基因组靶基因座包括TCR-β基因座。
133.根据权利要求132所述的细胞群体，其中由所述第二指定的核苷酸序列编码的无功能基因是被破坏的TCR-α基因。
134.根据权利要求96-129中任一项所述的细胞群体，其中所述内源基因组靶包括免疫检查点基因座。
135.根据权利要求134所述的细胞群体，其中所述免疫检查点基因座选自由以下组成的组：PD-1、CTLA-4、BTLA、TIM3、LAG3和VISTA。
136.根据权利要求96-135中任一项所述的细胞群体，其中所述基因的至少一部分包含接头序列。
137.根据权利要求136所述的细胞群体，其中所述接头序列编码可裂解接头多肽序列，其中在表达后，所述可裂解接头多肽被裂解，使得仅由所述基因的至少一部分编码的多肽被产生。
138.根据权利要求137所述的细胞群体，其中所述可裂解接头多肽包含选自由以下组成的组的2A核糖体跳跃元件：T2A、E2A、P2A和F2A。
139.根据权利要求137-138中任一项所述的细胞群体，其中所述可裂解接头多肽包含弗林蛋白酶裂解位点。
140.根据权利要求137-139中任一项所述的细胞群体，其中所述可裂解接头多肽包含Gly-Ser-Gly接头，任选地其中所述Gly-Ser-Gly接头是2A核糖体跳跃元件的N末端，并且任选地其中所述Gly-Ser-Gly接头呈从N末端至C末端的弗林蛋白酶裂解位点:Gly-Ser-Gly接头:2A核糖体跳跃元件取向。
141.根据权利要求136所述的细胞群体，其中所述接头序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。
142.根据权利要求136所述的细胞群体，其中所述接头序列包含外源启动子序列。
143.根据权利要求136-142中任一项所述的细胞群体，其中所述接头序列包含剪接受体序列。
144.根据权利要求96-135中任一项所述的细胞群体，其中所述基因的至少一部分包含第一接头多肽序列和第二接头多肽序列。
145.根据权利要求144所述的细胞群体，其中所述第一接头多肽序列和所述第二接头多肽序列包含相同的接头多肽序列。
146.根据权利要求145所述的细胞群体，其中编码相同的接头多肽序列的编码所述第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码所述第二接头多肽序列的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中编码所述第一接头多肽序列的核苷酸序列和编码所述第二接头多肽的核苷酸序列相对于彼此是密码子趋异的。
147.根据权利要求96-146中任一项所述的细胞群体，其中所述基因的至少一部分编码编码区。
148.根据权利要求147所述的细胞群体，其中所述编码区选自由以下组成的组：调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子、促进T细胞功能的因子和免疫检查点抑制剂。
149.根据权利要求96-146中任一项所述的细胞群体，其中所述基因的至少一部分编码非编码区。
150.根据权利要求149所述的细胞群体，其中所述非编码区选自由以下组成的组：shRNA、siRNA、miRNA、调节免疫系统的因子、细胞因子、调节T细胞功能的因子、促进T细胞存活的因子和促进T细胞功能的因子。
151.根据权利要求96-146中任一项所述的细胞群体，其中所述基因的至少一部分包括TCR基因的至少一部分。
152.根据权利要求151所述的细胞群体，其中所述TCR基因的至少一部分包含：
a)编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列；
b)编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列；和
c)编码第二接头序列的核苷酸序列。
153.根据权利要求151或152所述的细胞群体，其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或所述TCR基因的至少一部分选自由以下组成的组：鼠源化TCR、人源化TCR、结构域交换的TCR、点突变的TCR、具有能够形成二硫键的工程化半胱氨酸的工程化TCR、针对在人类中的表达而优化的密码子优化的TCR、针对密码子使用和去除RNA不稳定性元件而优化的序列优化的TCR、TCR基因的可变区序列、嵌合抗原受体(CAR)和单链TCR的至少一部分。
154.根据权利要求151-153中任一项所述的细胞群体，其中所述TCR-α多肽序列、所述TCR-β多肽序列或由所述TCR基因的至少一部分编码的多肽被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与第二外源TCR多肽序列更大程度的缔合，任选地，其中所述TCR-α多肽序列和所述TCR-β多肽序列被工程化为展示出相对于内源TCR多肽序列与彼此更大程度的缔合。
155.根据权利要求152-154中任一项所述的细胞群体，其中被编码的多肽序列呈接头:TCR-α:第二接头:TCR-β取向。
156.根据权利要求152-154中任一项所述的细胞群体，其中被编码的多肽序列呈接头:TCR-β:第二接头:TCR-α取向。
157.根据权利要求151-156中任一项所述的细胞群体，其中所述编码TCR-α多肽序列的核苷酸序列、所述编码TCR-β多肽序列的核苷酸序列或编码所述TCR基因的至少一部分的核苷酸序列包含密码子趋异的核苷酸序列，并且其中所述密码子趋异的核苷酸序列相对于内源核苷酸序列是密码子趋异的。
158.根据权利要求96-157中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包括人类细胞或人类来源的细胞。
159.根据权利要求96-158中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包括免疫细胞群体。
160.根据权利要求159所述的细胞群体，其中所述免疫细胞群体包括T细胞群体。
161.根据权利要求160所述的细胞群体，其中所述T细胞群体选自由以下组成的组：细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞、肿瘤浸润性T细胞、工程化T细胞、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、α-βT细胞和γ-δT细胞。
162.根据权利要求159所述的细胞群体，其中所述细胞群体包括选自由以下组成的组的群体：B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤T细胞。
163.根据权利要求96-158中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包括干细胞群体。
164.根据权利要求163所述的细胞群体，其中所述干细胞群体包括造血干细胞群体。
165.根据权利要求163所述的细胞群体，其中所述干细胞群体包括胚胎干细胞群体。
166.根据权利要求96-165中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是原代细胞。
167.根据权利要求96-166中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是分离的细胞群体，其中所述分离的细胞群体是从受试者分离的。
168.根据权利要求167所述的细胞群体，其中所述受试者已知或疑似患有癌症。
169.根据权利要求96-168中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包括离体培养的细胞。
170.根据权利要求169所述的细胞群体，其中所述离体培养的细胞包括经刺激的细胞。
171.根据权利要求170所述的细胞群体，其中所述经刺激的细胞包括细胞因子刺激的T细胞，任选地，其中所述细胞因子刺激的T细胞包括CD3刺激的T细胞、CD28刺激的T细胞或CD3和CD28刺激的T细胞。
172.根据权利要求171所述的细胞群体，其中所述细胞因子刺激的T细胞是在IL7、IL15或其组合的存在下培养的。
173.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：凯尔·马丁·雅各比，亚历克西斯·弗兰祖索夫，史蒂芬妮·曼德尔卡什曼，
申请(专利权)人：派克特制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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