用于活化和扩增自然杀伤细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术提供了预先活化并扩增分离的NK细胞群体的方法。本发明专利技术还提供了通过施用预先活化并扩增的NK细胞来治疗癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于活化和扩增自然杀伤细胞的方法及其用途本申请要求于2018年2月21日提交的美国临时专利申请号62/633,592的权益，该临时专利申请通过引用完整地结合于此。
技术介绍
1.
本专利技术一般地涉及医学和免疫学领域。更具体地，本专利技术涉及活化和扩增自然杀伤(NK)细胞的方法及其用途。2.相关技术描述已经研究自然杀伤(NK)细胞作为潜在的抗肿瘤效应物，然而许多障碍限制了它们的治疗开发，主要与它们数量少、过继免疫治疗需要离体扩增有关。细胞因子刺激构成一个重要信号来增强NK细胞响应于肿瘤靶细胞的功能能力。此外，已经显示用IL-18、IL-15和IL-12的组合预先活化NK细胞过夜产生了长期存活的、记忆样NK细胞，其在再刺激后具有增强的细胞因子产生(Leong等，2014)。然而，用IL-18、IL-15和IL-12预先活化的NK细胞的活性的表征研究已经使用直接从外周血(PB)中直接分离而没有离体扩增的NK细胞，离体扩增要求复杂且昂贵的程序诸如白细胞除去法以产生足够量用于临床应用。因此，存在对于以下的未满足的需求：以足以用于治疗应用的数量产生高度功能化的预先活化的NK细胞的改进的策略。
技术实现思路
因此，本专利技术的某些实施方案提供了涉及活化和扩增自然杀伤(NK)细胞的方法和组合物及其在细胞治疗中的用途。在第一个实施方案中，提供了一种扩增NK细胞的体外方法，所述方法包括：获得NK细胞群体；在预先活化培养物中预先活化NK细胞群体以获得预先活化的NK细胞，所述预先活化培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18；和在扩增培养物中扩增所述预先活化的NK细胞，由此产生扩增的NK细胞，所述扩增培养物包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。在一些方面，NK细胞群体获自脐带血(CB)、外周血(PB)、干细胞或骨髓。在具体方面，干细胞是诱导性多能干细胞。在特定方面，分离的NK细胞群体获自CB，诸如汇集的CB。在一些方面，CB由2个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8或更多个)个体脐带血单元汇集而成。在某些方面，分离的NK细胞群体是CB单核细胞(CBMC)。在一些方面，分离的NK细胞群体进一步限定为CD56+NK细胞。在某些方面，aAPC进一步表达膜结合细胞因子。在一些方面，膜结合细胞因子是膜结合IL-21(mIL-21)或膜结合IL-15(mIL-15)。在一些方面，膜结合细胞因子是mIL-21。在一些方面，aAPC基本上不表达内源性HLAI类、II类或CD1d分子。在某些方面，aAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。在一些方面，aAPC进一步限定为来源于白血病细胞的aAPC。在某些方面，来源于白血病细胞的aAPC进一步限定为K562细胞，其被改造为表达CD137配体和/或mIL-21。在一些方面，K562细胞被改造为表达CD137配体和mIL-21。在某些方面，改造进一步限定为逆转录病毒转导。在具体方面，aAPC是被辐照的。在一些方面，预先活化步骤持续10-20小时，诸如14-18小时(例如，大约14、15、16、17或18小时)，特别是大约16小时。在某些方面，预先活化培养物包含浓度为10-100ng/mL、诸如40-60ng/mL、特别是大约50ng/mL的IL-18和/或IL-15。在一些方面，预先活化培养物包含浓度为0.1-150ng/mL、诸如1-20ng/mL、特别是大约10ng/mL的IL-12。在某些方面，该方法还包括在扩增之前洗涤预先活化的NK细胞。在一些方面，洗涤进行多次，诸如2、3或4次。在一些方面，扩增持续5-20天，诸如12-16天(例如，12、13、14、15或16天)，特别是大约14天。在某些方面，预先活化的NK细胞和aAPC以3:1至1:3的比率存在于扩增培养物中。在特定方面，预先活化的NK细胞和aAPC以大约1:2的比率存在于扩增培养物中。在另外的方面，扩增培养物还包含IL-2。在一些方面，IL-2以10-500U/mL、诸如100-300U/mL、特别是大约200U/mL的浓度存在。在一些方面，IL-12、IL-18、IL-15和/或IL-2是重组人IL-2。在一些方面，每2-3天在扩增培养物中补充IL-2。在一些方面，将aAPC至少第二次加入扩增培养物中。在一些方面，该方法在无血清培养基中进行。在另外的方面，改造NK细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，CAR包含CD19、CD123、间皮素(mesothelin)、CD5、CD47、CLL-1、CD33、CD99、U5snRNP200、CD200、CS1、BAFF-R、ROR-1、或BCMA抗原结合结构域。在一些方面，CAR包含人源化抗原结合结构域。在一些方面，CAR包含IL-15。在一些方面，CAR包含自杀基因。在特定方面，自杀基因是CD20、CD52、EGFRv3或诱导型胱天蛋白酶9。另外的实施方案提供了根据实施方案(例如，获得分离的NK细胞群体；在预先活化培养物中预先活化分离的NK细胞群体以获得预先活化的NK细胞，所述预先活化培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18；和在扩增培养物中扩增所述预先活化的NK细胞，由此产生扩增的NK细胞，所述扩增培养物包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC))扩增的NK细胞群体。此外，本文还提供药物组合物，其包含实施方案的扩增的NK细胞群体和药用载体。在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含了有效量的实施方案(例如，获得分离的NK细胞群体；在预先活化培养物中预先活化分离的NK细胞群体以获得预先活化的NK细胞，所述预先活化培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18；和在扩增培养物中扩增所述预先活化的NK细胞，由此产生扩增的NK细胞，所述扩增培养物包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC))的扩增的NK细胞，所述组合物用于治疗受试者中的疾病或病症。本文还提供了治疗受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案的扩增的NK细胞。在上述实施方案的一些方面中，所述疾病或病症是癌症、炎症、移植物抗宿主病、移植排斥、自身免疫病、免疫缺陷病、B细胞恶性病或感染。在某些方面，癌症是白血病。在某些方面，白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓性白血病(AML)或慢性髓性白血病(CML)。在一些方面，NK细胞是同种异体的。在其他方面，NK细胞是自体的。在某些方面，受试者是人。在某些方面，病症是移植物抗宿主病(GVHD)。在一些方面，病症是多发性硬化、炎性肠病、类风湿关节炎、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、接触性超敏反应、哮喘或舍格伦综合征(Sjogren'ssyndrome)。在一些方面，该方法进一步包含施用至少第二治疗剂。在某些方面，所述至少第二治疗剂是治疗有效量的抗癌剂、免疫调节剂或免疫抑制剂。在一些方面，抗癌剂是化疗、放疗、基因疗法、手术、激素疗法、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增自然杀伤(NK)细胞的体外方法，所述方法包括：/n(a)获得NK细胞群体；/n(b)在预先活化培养物中预先活化所述NK细胞群体以获得预先活化的NK细胞，所述预先活化培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18；和/n(c)在扩增培养物中扩增所述预先活化的NK细胞，由此产生扩增的NK细胞，所述扩增培养物包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180221 US 62/633,5921.一种扩增自然杀伤(NK)细胞的体外方法，所述方法包括：
(a)获得NK细胞群体；
(b)在预先活化培养物中预先活化所述NK细胞群体以获得预先活化的NK细胞，所述预先活化培养物包含有效浓度的IL-12、IL-15和IL-18；和
(c)在扩增培养物中扩增所述预先活化的NK细胞，由此产生扩增的NK细胞，所述扩增培养物包含表达CD137配体的人工抗原呈递细胞(aAPC)。


2.权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞群体获自脐带血(CB)、外周血(PB)、干细胞或骨髓。


3.权利要求2所述的方法，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞。


4.权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞群体获自CB。


5.权利要求4所述的方法，其中所述CB由2个或更多个个体脐带血单元汇集而成。


6.权利要求4所述的方法，其中所述CB由3、4、5、6、7或8个个体脐带血单元汇集而成。


7.权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞群体是CB单核细胞(CBMC)。


8.权利要求1所述的方法，其中所述NK细胞群体进一步限定为CD56+NK细胞。


9.权利要求1所述的方法，其中所述aAPC进一步表达膜结合细胞因子。


10.权利要求9所述的方法，其中所述膜结合细胞因子是膜结合IL-21(mIL-21)或膜结合IL-15(mIL-15)。


11.权利要求9所述的方法，其中所述膜结合细胞因子是mIL-21。


12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述aAPC基本上不表达内源性HLAI类、II类或CD1d分子。


13.权利要求1所述的方法，其中所述aAPC表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。


14.权利要求1所述的方法，其中所述aAPC进一步限定为来源于白血病细胞的aAPC。


15.权利要求14所述的方法，其中所述来源于白血病细胞的aAPC是经改造表达CD137配体和/或mIL-21的K562细胞。


16.权利要求15所述的方法，其中所述K562细胞被改造为表达CD137配体和mIL-21。


17.权利要求15所述的方法，其中所述aAPC通过逆转录病毒转导改造。


18.权利要求1所述的方法，其中所述aAPC是被辐照的。


19.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化步骤持续10-20小时。


20.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化步骤持续14-18小时。


21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述预先活化步骤持续16小时。


22.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为10-100ng/mL的IL-18和/或IL-15。


23.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为40-60ng/mL的IL-18和/或IL-15。


24.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为50ng/mL的IL-18和/或IL-15。


25.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为0.1-150ng/mL的IL-12。


26.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为1-20ng/mL的IL-12。


27.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化培养物包含浓度为10ng/mL的IL-12。


28.权利要求1所述的方法，其另外包括在扩增之前洗涤所述预先活化的NK细胞。


29.权利要求28所述的方法，其中洗涤进行多次。


30.权利要求1所述的方法，其中所述扩增持续5-20天。


31.权利要求1所述的方法，其中所述扩增持续12-16天。


32.权利要求1所述的方法，其中所述扩增持续14天。


33.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化的NK细胞和aAPC以3:1至1:3的比率存在于所述扩增培养物中。


34.权利要求1所述的方法，其中所述预先活化的NK细胞和aAPC以1:2的比率存在于所述扩增培养物中。


35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述扩增培养物还包含IL-2。


36.权利要求35所述的方法，其中所述IL-2以10-500U/mL的浓度存在。


37.权利要求35所述的方法，其中所述IL-2以100-300U/mL的浓度存在。


38.权利要求35所述的方法，其中所述IL-2以200U/mL的浓度存在。

【专利技术属性】
技术研发人员：L·N·克宝，E·施帕尔，K·雷兹瓦尼，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US