【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域，包括癌症医学。
技术介绍
1、复发难治性t细胞恶性肿瘤代表一组预后特别差的血液系统恶性肿瘤，迫切需要新的疗法。cd5是大多数t细胞恶性肿瘤中存在的泛t细胞表面标志物。它也由一些b细胞恶性肿瘤如套细胞淋巴瘤(mcl)和慢性淋巴细胞白血病(cll)表达1,2。另一方面，正常细胞的cd5表达仅限于胸腺细胞、外周t细胞和少量b淋巴细胞亚群，其他造血细胞不表达。因此，cd5是过继car改造细胞疗法的重要靶抗原。然而，靶向t细胞来源肿瘤的car-t细胞的开发受到大多数可靶向抗原在恶性和正常t淋巴细胞上均有表达的阻碍，这可能会促进car-t细胞自相残杀3。尽管存在自相残杀的问题，cd5car-t细胞已被成功开发，并在初步报告中显示出临床前疗效4和在t细胞恶性肿瘤患者中的临床安全性以及临床疗效的早期迹象5。尽管如此，使用表面不表达cd5的替代免疫效应细胞将是一种有吸引力的方法，因为它将消除任何自相残杀的担忧。nk细胞作为car改造以靶向cd5的平台是一种有吸引力的替代方案，因为它们不在其表面表达这种抗原。nk细胞用于car改造的另一个优点是，与t细胞相比，它们在同种异体环境中不会引起移植物抗宿主病(gvhd)，从而有可能产生完全现成的细胞产品以在护理点使用。开发了一种新的平台，用于基因修饰cb来源的nk细胞以表达car，异位产生il-15以支持nk细胞在体内的增殖和持久性，并表达自杀基因，诱导型半胱天冬酶9(ic9)，以解决任何潜在的安全问题6。这些ic9/car19/il1
2、多项研究表明，car-t细胞共刺激结构域的选择影响其功能、持久性和代谢情况8-10。在car-nk细胞领域，临床上测试的第一个构建体结合了cd28(一种t细胞特异性共刺激结构域)，借鉴了car-t细胞的设计。有一些临床前car-nk细胞研究观察各种nk特异性共刺激分子的功能，但没有研究系统地观察共刺激结构域对nk细胞的增殖、转录组学和蛋白质组学特征、多功能性、代谢和适应性的影响。本专利技术中，其目的是通过全面研究共刺激结构域的影响，包括一些与nk细胞生物学更相关的结构域，即dnax激活蛋白10(dap10，一种主要的衔接蛋白和nkg2d在人类nk细胞中的独家信号传导中间体)、dnax激活蛋白12(dap12，一种重要的衔接分子，与多种激活受体(例如nkg2c、nkp44、激活kir)相关)，和nkg2d(其是对抗肿瘤免疫至关重要的最有效的nk细胞毒性受体之一)11。结果表明，与含有其他共刺激分子的cd5 car-nk细胞相比，具有dap10共刺激分子的cd5car-nk细胞在体外和体内表现显著更好，并显示出增强的多功能性、代谢适应性和记忆样特征，从而增强了其抗肿瘤活性。基于这些临床前数据，正在准备评估cd5-dap10-cd3ζcar-nk细胞安全性和有效性的i/ii期临床试验。
3、因此，本专利技术在特定的实施方案中涉及用于过继细胞疗法的细胞(包括人nk细胞)的遗传改造的方法和组合物，以靶向包括cd5阳性癌症在内的癌症。
技术实现思路
1、本专利技术的实施方案包括与靶向cd5(例如也称为分化簇5或leu1或t1)的改造细胞受体相关的方法和组合物。在特定实施方案中，靶向cd5的改造受体呈多核苷酸、多肽的形式，或包含在任何种类的细胞(包括免疫细胞)的表面上。在特定情况下，所述细胞是免疫细胞，并且在某些实施方案中，免疫细胞是来自任何来源的nk细胞、nk t细胞、不变nkt细胞、γδt细胞、调节性t细胞、b细胞、巨噬细胞、间充质基质细胞(msc)、树突细胞等。在某些实施方案中，包括来自脐带血(cb-nk)的重编程nk细胞用于靶向表达cd5分子的癌症。
2、cd5被用作方法和组合物的靶抗原，因为它在多种癌症上表达，包括慢性淋巴增生性疾病/淋巴瘤、t细胞白血病(t-all)、t细胞淋巴瘤以及一些b细胞恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤。它也在胸腺癌以及甲状腺癌、肝癌、结直肠癌和宫颈癌中表达。
3、在特定实施方案中，本专利技术的过继细胞疗法(包括nk细胞疗法)对于即使在再次暴露于癌症时也能特别有效地根除癌细胞。因此，在一些实施方案中，可以在个体中不存在可检测到的癌症的情况下为个体提供本文所涵盖的任何细胞疗法。在特定情况下，个体可能有患任何类型癌症的风险，例如比普通人群的风险更高。在某些情况下，个体可能已经接受了一种或多种癌症治疗，并且在施用本专利技术的细胞疗法时可能被认为是无癌的，也可能不被认为是无癌的。因此，在各种实施方案中，存在一种在个体中预防癌症或预防癌症转移的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文所涵盖的任何细胞的步骤。施用步骤可能发生一次或多于一次。当发生多于一次时，施用之间可能有任何合适的持续时间，包括1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。
4、已经测试了靶向cd5的car t细胞的一些实施方案对t细胞恶性肿瘤的治疗。然而，cd5由正常t细胞以及t细胞白血病/淋巴瘤组成型表达，其在car t细胞疗法中的应用将需要cd5基因的遗传缺失以防止car t制造过程中的自相残杀。相反，由于正常nk细胞不表达cd5，因此它们不会受到自相残杀的影响。因此，在本专利技术的特定实施方案中，nk细胞(包括来自脐带血(cb))是重编程的nk细胞以靶向表达cd5的癌症。本专利技术包括许多新型car分子，包括靶向人cd5抗原的scfv与一个或多个活化信号传导内结构域的融合，包括在某些情况下单独掺入cd3ζ或与共刺激或衔接子信号传导结构域(例如nkg2d、41bb、cd28、dap10和/或dap12)组合。在特定情况下，同种异体cb-nk细胞被逆转录病毒转导以表达cd5 car。
5、在特定实施方案中，包含cd5 car分子的本专利技术免疫细胞也表达一种或多种支持其存活和增殖的蛋白。在特定情况下，免疫细胞被改造以表达一种或多种促进细胞扩增和持久性的细胞因子。在特定情况下，细胞因子是白细胞介素15(il-15)、il-2、il-7、il-12、il-18和/或il-21，其有助于免疫细胞(例如nk细胞)的存活和维持。在某些方面，编码car的载体也编码细胞因子，并且每个最终都作为单独的多肽产生。
6、本专利技术的实施方案涵盖多种新颖的特异性car构建体，其掺入与一个或多个信号传导结构域(包括例如包含cd3ζ细胞质部分的那些以及cd28，dap10、dap12和nkg2d中的一个或多个)异源融合的cd5 scfv。在某些情况下，scfv可以包含源自对人cd5抗原具有特异性的鼠或人抗体的重链(vh)和轻链(vl)本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种表达构建体，其包含编码CD5特异性改造受体的序列，其中所述受体包含以下之一：
2.权利要求1所述的表达构建体，其中所述CD5特异性改造受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。
3.表达构建体，其中CD5特异性改造受体是CAR。
4.权利要求3所述的表达构建体，其中所述CAR包含作为scFv或CD5配体的CD靶向性细胞外结构域。
5.权利要求4所述的表达构建体，其中CD5特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，并且其中在编码CAR的序列中，在5'至3'方向上，所述重链位于所述轻链的上游。
6.权利要求4所述的表达构建体，其中CD5特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，并且其中在编码CAR的序列中，在5′至3′方向上，所述重链位于所述轻链的下游。
7.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中CD5特异性CAR包含密码子优化的scFv。
8.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中CD5特异性CAR包含人源化scFv。
9.权利要求4-6或8中任一项所述的表达构建体，
10.权利要求4-6或8中任一项所述的表达构建体，其中所述scFv包含SEQ ID NO:2。
11.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中所述scFv由SEQ ID NO:3编码。
12.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中所述scFv包含SEQ ID NO:4。
13.权利要求3-12中任一项所述的表达构建体，其中CD5特异性CAR包含信号传导肽。
14.权利要求13所述的表达构建体，其中所述信号传导肽来自CD8α、Ig重链、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体、CD3信号传导肽、CD4信号传导肽或源自一种或多种其他表面受体的信号肽。
15.权利要求1-14中任一项所述的表达构建体，其中所述TM由SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13编码。
16.权利要求1-14中任一项所述的表达构建体，其中所述TM包含SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14。
17.权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中所述ICD由SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21编码。
18.权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中所述ICD包含SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22。
19.权利要求1-18中任一项所述的表达构建体，其中所述受体进一步包含来自以下的ICD：CD27、OX-40(CD134)、CD40L、2B4、DNAM、CS1、CD48、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、ICOS或其组合。
20.权利要求1-19中任一项所述的表达构建体，其中所述CD5特异性改造受体是CD5特异性CAR，其包含在CD5特异性scFv和跨膜结构域之间的铰链。
21.权利要求20所述的表达构建体，其中所述铰链是IgG铰链、CD28铰链、CD8α铰链，所述铰链包含由Gly3组成的人工间隔子，或者所述铰链包含IgG的CH1、CH2和/或CH3结构域。
22.权利要求21所述的表达构建体，其中所述IgG铰链是IgG1铰链、IgG2铰链、IgG3铰链或IgG4铰链。
23.权利要求21所述的表达构建体，其中所述铰链由SEQ ID NO:23或25编码。
24.权利要求21所述的表达构建体，其中所述铰链包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26。
25.权利要求1-24中任一项所述的表达构建体，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7、IL-23或其组合。
26.权利要求1-25中任一项所述的表达构建体，其中所述CD5特异性改造受体是由SEQID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQID NO:45或SEQ ID NO:47编码的CAR。
27.权利要求1-25中任一项所述的表达构建体，其中所述CD5特异性改造受体是包含SEQ ID NO:34、SEQ ...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种表达构建体，其包含编码cd5特异性改造受体的序列，其中所述受体包含以下之一：
2.权利要求1所述的表达构建体，其中所述cd5特异性改造受体是嵌合抗原受体(car)或t细胞受体。
3.表达构建体，其中cd5特异性改造受体是car。
4.权利要求3所述的表达构建体，其中所述car包含作为scfv或cd5配体的cd靶向性细胞外结构域。
5.权利要求4所述的表达构建体，其中cd5特异性car包含具有重链和轻链的scfv，并且其中在编码car的序列中，在5'至3'方向上，所述重链位于所述轻链的上游。
6.权利要求4所述的表达构建体，其中cd5特异性car包含具有重链和轻链的scfv，并且其中在编码car的序列中，在5′至3′方向上，所述重链位于所述轻链的下游。
7.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中cd5特异性car包含密码子优化的scfv。
8.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中cd5特异性car包含人源化scfv。
9.权利要求4-6或8中任一项所述的表达构建体，其中所述scfv由seq id no:1编码。
10.权利要求4-6或8中任一项所述的表达构建体，其中所述scfv包含seq id no:2。
11.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中所述scfv由seq id no:3编码。
12.权利要求4-6中任一项所述的表达构建体，其中所述scfv包含seq id no:4。
13.权利要求3-12中任一项所述的表达构建体，其中cd5特异性car包含信号传导肽。
14.权利要求13所述的表达构建体，其中所述信号传导肽来自cd8α、ig重链、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体、cd3信号传导肽、cd4信号传导肽或源自一种或多种其他表面受体的信号肽。
15.权利要求1-14中任一项所述的表达构建体，其中所述tm由seq id no:5、seq idno:7、seq id no:9、seq id no:11或seq id no:13编码。
16.权利要求1-14中任一项所述的表达构建体，其中所述tm包含seq id no:6、seq idno:8、seq id no:10、seq id no:12或seq id no:14。
17.权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中所述icd由seq id no:15、seq idno:17、seq id no:19或seq id no:21编码。
18.权利要求1-16中任一项所述的表达构建体，其中所述icd包含seq id no:16、seqid no:18、seq id no:20或seq id no:22。
19.权利要求1-18中任一项所述的表达构建体，其中所述受体进一步包含来自以下的icd：cd27、ox-40(cd134)、cd40l、2b4、dnam、cs1、cd48、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80、icos或其组合。
20.权利要求1-19中任一项所述的表达构建体，其中所述cd5特异性改造受体是cd5特异性car，其包含在cd5特异性scfv和跨膜结构域之间的铰链。
21.权利要求20所述的表达构建体，其中所述铰链是igg铰链、cd28铰链、cd8α铰链，所述铰链包含由gly3组成的人工间隔子，或者所述铰链包含igg的ch1、ch2和/或ch3结构域。
22.权利要求21所述的表达构建体，其中所述igg铰链是igg1铰链、igg2铰链、igg3铰链或igg4铰链。
23.权利要求21所述的表达构建体，其中所述铰链由seq id no:23或25编码。
24.权利要求21所述的表达构建体，其中所述铰链包含seq id no:24或seq id no:26。
25.权利要求1-24中任一项所述的表达构建体，其中所述细胞因子是il-15、il-12、il-2、il-18、il-21、il-7、il-23或其组合。
26.权利要求1-25中任一项所述的表达构建体，其中所述cd5特异性改造受体是由seqid no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seqid no:45或seq id no:47编码的car。
27.权利要求1-25中任一项所述的表达构建体，其中所述cd5特异性改造受体是包含seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46或seq id no:48的car。
28.权利要求1-27中任一项所述的表达构建体，其中除了cd5特异性改造受体之外，所述表达构建体编码感兴趣的多肽。
29.权利要求28所述的表达构建体，其中所述感兴趣的多肽和所述cd特异性改造受体在构建体上通过2a元件或ires元件分隔开。
30.权利要求29所述的表达构建体，其中所述2a元件是e2a、t2a或p2a。
31.权利要求30所述的表达构建体，其中所述e2a元件由seq id no:31编码。
32.权利要求30所述的表达构建体，其中所述e2a元件包含seq id no:32。
33.权利要求28-32中任一项所述的表达构建体，其中所述目的多肽是治疗性蛋白或增强细胞的细胞活性、扩增和/或持久性的蛋白，所述细胞包含所述蛋白。
34.权利要求28-33中任一项所述的表达构建体，其中所述目的多肽是：自杀基因；细胞因子；增强包含人或病毒蛋白的细胞的增殖、扩增和/或代谢适应性的所述人或病毒蛋白；或其组合。
35.权利要求34所述的表达构建体，其中所述自杀基因是非分泌性突变tnf-α、诱导型半胱天冬酶9、hsv-胸苷激酶、cd19、cd20、cd52或egfrv3。
36.权利要求34或35所述的表达构建体，其中所述细胞因子是il-15、il-2、il-12、il-18、il-21、il-23、il-7或其组合。
37.权利要求36所述的表达构建体，其中所述il-15由seq id no:29编码。
38.权利要求36所述的表达构建体，其中所述il-15包含seq id no:30。
39.一种载体，其包含权利要求1-38中任一项所述的表达构建体。
40.权利要求39所述的载体，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。
41.权利要求40所述的载体，其中所述病毒载体是腺...
【专利技术属性】
技术研发人员：K·雷兹瓦尼，E·施帕尔，R·巴萨尔，M·达希尔，S·阿查亚，N·尤普赖特瑞，A·K·努涅斯科尔特斯，E·恩斯雷，D·马林科斯达，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：
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