本发明专利技术涉及一种甲型肝炎病毒生产方法以及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，更具体涉及：一种甲型肝炎病毒生产方法以及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，所述方法包括以下步骤：用包含表达盒的用于甲型肝炎病毒制备的载体转化宿主细胞获得的病毒感染宿主细胞，所述表达盒包含甲型肝炎病毒基因，并将宿主细胞传代培养。培养。培养。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甲型肝炎病毒制备方法和根据该方法制备的甲型肝炎病毒
[0001]本申请要求2019年12月19日提交的韩国专利申请第10
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2019
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0171279号的优先权，其全部内容为本申请的参考。
[0002]本专利技术涉及一种甲型肝炎病毒的生产方法及根据该方法生产的甲型肝炎病毒，更具体涉及一种甲型肝炎病毒的制备方法及根据该方法制备的甲型肝炎病毒，所述方法包括用病毒感染宿主细胞并传代培养所述宿主细胞，所述病毒是通过用插入了包含甲型肝炎病毒基因的表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染宿主细胞而获得的。
技术介绍
[0003]甲型肝炎是韩国70％以上急性病毒性肝炎的最重要原因。甲型肝炎病毒(HAV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，大小约为27nm，无包膜，核酸为单链RNA。在平均28天的潜伏期后，HAV会引起急性肝病，特征在于临床症状如发热、厌食、恶心和呕吐、腹痛、尿色深和黄疸(SM Lemon et al.J.Hepatol,68(1):167
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184(2018)；Totsuka and Moritsugu,Intervirology,42:63
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68(1999))。根据过去10年的一项调查，美国西部、中东和一些亚洲地区的甲型肝炎患者正在增加，令人担忧甲型肝炎疾病的全球传播。即使在韩国，感染甲型肝炎的人数也在10多岁和20多岁没有免疫力的年轻人中迅速增加(Nwachuku and Gerba,Rev.Environ.Contam.Toxicol.186:1
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56(2006)；Kim and Lee,Intervirology,53(1):10
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14(2010)；Korea Centers for Disease Control and Prevention(KCDC)Infectious Diseases Portal Legal Infectious Disease Statistics by Disease
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Hepatitis A)。特别是在学习年龄的青少年或考试对象的情况下，甲型肝炎病毒感染会因住院和治疗而造成人身和经济损失。在美国，众所周知，每名甲肝患者的直接和间接费用为成人$2500美元，18岁以下的人约$1500美元，每年因甲肝引起的医疗费用超过3亿美元(World Health Organization，1999)。
[0004]甲型肝炎的主要传播途径是粪口途径，甲型肝炎通过受污染的食物或饮用水传播。Advisory committee on immunization practices(ACIP)建议对前往甲型肝炎病毒流行地区的出境旅行者和相应地区的工人、男男性行为者(MSM)、乙型肝炎患者、慢性肝病患者和慢性肾功能衰竭患者以及生活在甲型肝炎高发地区的儿童群体进行疫苗接种(Nelson NP,Weng MK,Hofmeister MG,et al.Prevention of Hepatitis A Virus Infection in the United States:Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices,2020.MMWR Recomm Rep 2020；69(No.RR
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5):1
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38.DOI:http://dx.doi.org/10.15585/mmwr.rr6905a1)。
[0005]为制备甲型肝炎疫苗，必然伴随着甲型肝炎病毒(HAV)的制备，但甲型肝炎病毒的复制速度非常慢(Cromeans et al.J.Gen.Virol.70:2051
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2062(1989))。通常感染人的病毒，孵育短至2至3天或长至7天即可分离和复制，但甲型肝炎病毒短则培养约一个月才可获得病毒。相当于一个月的时间也仅限于病毒很好地适应培育细胞的情况。用于扩增甲型肝炎病毒的对甲型肝炎病毒高度敏感的细胞系(例如原代AGMK细胞、FRhK
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4、BS
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C
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1)不适合
作为生产疫苗的细胞。这些细胞系尚未针对适合用作人类疫苗生产细胞系的细胞系表征和稳定性进行验证。特别地，已建立示例的细胞作为能够在培养瓶等中进行体外培养的细胞系，但被归类为来自属于CITES限制的国际濒危物种猕猴科(Cercopithecidae)的猕猴(Macaca mulatta)和非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的材料，因此很难从分发和商业销售细胞系的ATCC(美国)进口到韩国。
[0006]为从人粪便样本中分离并在病毒生产细胞系中高产量生产，需要大约50个病毒感染传代培养物来使HAV适应所述病毒生产细胞系。例如，在商业疫苗Havrix的主种子病毒(HAV 4380或MRC5/9，主种子)的情况下，将人源wt HM
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175(人粪便悬浮液)在原代AGMK(非洲绿猴)细胞中进行32代传代以确认适应细胞培养物的病毒。然后，将相应病毒(P
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32AGMK细胞适应的)在MRC
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5细胞系中传代培育37代并分离为病毒克隆(克隆25
‑4‑
21)，并将所述克隆在MRC
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5中再次孵育(第38代)。此后，将在MRC
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5细胞中通过病毒感染另外传代3次的第41代病毒用作主种子原种，将其称作HAV 4380(US6423318B1)。
[0007]甲型肝炎疫苗须接受政府指定的强制性疫苗接种，但在HAV流行期间经常供不应求。葛兰素史克(GSK)的Havrix、默克公司的Vaqta等全球最常用的甲型肝炎疫苗在2019年甲型肝炎流行的韩国被抢购一空，随后遭受供需困难重创，例如在2019年底停供。在2017年同样出现了这些疫苗的供需失衡问题，但供需不稳定甚至在2019年也没有解决，当时突然爆发甲型肝炎传播。目前，甲型肝炎疫苗已被保健福祉部(Ministry of Health and Welfare)列入2020年全国预防接种疫苗储备计划以稳定疫苗供需并正在努力解决这一问题。这种供需不稳定的原因是目前没有用甲型肝炎疫苗国内技术开发的商业化疫苗。
技术实现思路
[0008]技术问题
[0009]本专利技术人为了解决上述技术问题并开发出能够稳定快速生产甲型肝炎病毒的方法而反复潜心研究，结果发现了一种将约50次的传代培养步骤缩短至仅6次即可获得病毒的方法以及在病毒生产细胞系中以更高产量表达的最佳基因表达盒组合。然后，本专利技术人发现，用包含甲型肝炎病毒的遗传和功能位点的表达载体感染宿主细胞获得的病毒，通过反复传代培养以惊人的速度复制，以快速稳定地产生甲型肝炎病毒，然后完成了本专利技术。
[0010]因此，本专利技术的一个目的是提供一种由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.由SEQ ID NO:1定义的甲型肝炎病毒基因。2.用于制备甲型肝炎病毒的表达盒，其包含权利要求1的甲型肝炎病毒基因。3.权利要求2的表达盒，其中所述表达盒包含启动子、锤头(HH)核酶和丁型肝炎病毒(HDV)核酶。4.权利要求2的表达盒，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。5.用于制备甲型肝炎病毒的载体，其包含权利要求2至4任一项的表达盒。6.用权利要求5的载体制备的甲型肝炎病毒。7.用于制备疫苗的甲型肝炎病毒的制备方法，包括以下步骤：(a)用包含表达盒的用于制备甲型肝炎病毒的载体转染宿主细胞，所述表达盒包含SEQ ID NO:1的甲型肝炎病毒基因；(b)从所述宿主细胞中获得病毒；(c)用获得的病毒感染宿主细胞并传代培养感染的宿主细胞；及(d)从所述宿主细胞中获得病毒。8.权利要求7的制备方法，其中所述表达盒在甲型肝炎病毒基因5
’
端方向依次包含CMV启动子、T7启动子、多克隆位点(MCS)和锤头(HH)核酶位点，以及在3
’
端方向依次包含丁型肝炎病毒(HDV)核酶、MCS和poly
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A尾。9.权利要求7的制备方法，其中所述表达盒包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。10.权利要求7的制备方法，其中所述宿主细胞选自Vero、MA104、W...
【专利技术属性】
技术研发人员：李定恩，金秀映，曹舒映，金勋，李建世，李受陈，
申请(专利权)人：SK生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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