用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法技术

在某些方面，本公开涉及定量重组载体核酸整合到靶细胞基因组中的方法。本公开还提供了用于执行该定量的包括特定引物和探针的组合物和试剂盒。物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2020年3月9日提交的美国临时专利申请62/987019和2021年2月11日提交的美国临时专利申请63/148300的权益，这些专利申请据此全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ASCII拷贝创建于2021年2月24日，命名为PRD4079WOPCT1_SL.txt，并且大小为21,861字节。

技术介绍

[0005]在理解基因组材料的递送和整合到靶细胞基因组中的最新进展具有改变各种疾病的护理标准的巨大潜力。嵌合抗原受体(“CAR”)T细胞疗法已经显示出治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症诸如淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、肉瘤、神经母细胞瘤和某些实体瘤癌症的潜力(参见例如，Sadelain等人，Cancer Discovery，第3卷：第388
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398页，2013年，以及Titov等人，Cancer，第12卷：第125
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146页，2020年)，并且通常涉及在体外修饰T细胞以产生表达CAR的T细胞。大多数工程化用于人类应用的T细胞基因操作方法都使用逆转录病毒，诸如慢病毒，用于嵌合抗原受体(CAR)的稳定表达(Jena等人，2010年；Ertl等人，2011年；Kohn等人，2011年)。然而，目前使用病毒载体递送的整合技术的挑战之一是确定载体是否不仅已经进入细胞，而且确定转基因是否成功整合到宿主基因组中(称为“病毒整合”的过程)以及整合的次数(或病毒整合的频率)。
[0006]Southern印迹最初是测量逆转录病毒载体序列拷贝数整合的优选技术，但由于需要手工劳动，因此速度慢且成本高。最近，研究人员已经开发了定量PCR(“qPCR”)方法以确定转导效率和拷贝数。一些方法无法区分自由的未掺入的载体和整合的载体，因此只是对拷贝数的估计。参见例如Charrier等人，Gene Therapy，第18卷：第479
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487页，2011年。一些其他方法使用特定于特定转基因的引物。参见Hum.Gene Ther.，第14卷：第497
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507页，2003年。然而，这些方法要么无法产生精确的拷贝数，要么由于需要为每个转基因设计不同的特异性引物而成本高昂。

技术实现思路

[0007]本公开提供了定量重组载体核酸(通常包括转基因)整合到靶细胞基因组中的方法，这些方法不受任何特定转基因的限制或特定于任何特定转基因。本公开还提供了用于执行该定量的包括特定引物和探针的组合物和试剂盒。
[0008]在一个方面，本公开提供了一种定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法，该方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交；以及(c)定量通过步
骤(b)扩增的基因组核酸。
[0009]在一些实施方案中，定量包括确定拷贝数。在一些实施方案中，定量扩增技术是定量PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是数字PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是微滴式数字PCR。在一些实施方案中，定量扩增技术是终点PCR。
[0010]在某些实施方案中，定量重组载体核酸在宿主细胞基因组中的整合进一步包括将生物样品的整合的重组载体序列拷贝数与参考多核苷酸序列进行比较。在一些实施方案中，参考多核苷酸序列编码管家蛋白。在一些实施方案中，管家蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，以多重方式测量整合的重组载体序列拷贝数和参考多核苷酸序列拷贝数。在一些实施方案中，以单重方式测量整合的重组载体序列拷贝数和参考多核苷酸序列拷贝数。
[0011]在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个测定接受标准来评价用于定量重组载体核酸整合的测定的有效性：(a)在不含模板DNA的对照的所有复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环是无法确定的；(b)使用标准样品通过线性回归生成的前病毒和参考多核苷酸序列两者的标准曲线的相关系数大于或等于0.97；(c)从所述标准曲线的斜率估计的前病毒和参考多核苷酸序列的拷贝值表明PCR效率介于90％和110％之间；(d)在标准样品中的任一者的复制品中，前病毒和参考多核苷酸序列两者没有一个的阈值循环是无法确定的；(e)基础标准样品中前病毒和参考多核苷酸序列两者的平均阈值循环小于或等于22.0；(f)每个标准样品中的前病毒和参考多核苷酸序列两者的阈值循环中的标准偏差小于或等于0.60；(g)该一个或多个阳性对照样品的参考多核苷酸序列的平均测量拷贝在标称预期值的30％内；(h)该一个或多个阳性对照样品的所测量的平均VCN/细胞值在每个对照的标称预期VCN/细胞值的30％内；以及(i)该一个或多个阳性对照样品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％。
[0012]在一些实施方案中，该方法进一步包括通过评估选自由以下项组成的组的一个或多个样品接受标准来评价对于样品定量重组载体核酸整合的有效性：(a)样品中参考多核苷酸序列的平均拷贝值在30,303.030拷贝的预期值的30％内；(b)如果样品的基因组DNA(gDNA)浓度低于0.02μg/μL，则该样品的参考多核苷酸序列的预期拷贝根据实际加载到反应中的DNA量计算；(c)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于测定的拷贝值的验证范围之间；(d)样品中的平均靶前病毒拷贝值介于121,212.121和193.939拷贝之间；(e)靶样品复制品的VCN/细胞值的变异系数小于或等于20％；以及(f)样品中的靶前病毒和靶参考多核苷酸序列两者的循环阈值中的标准偏差小于或等于0.60。
[0013]在一些实施方案中，重组载体包含转基因。在一些实施方案中，重组载体是基因疗法载体。在一些实施方案中，重组载体是病毒载体。在一些实施方案中，重组载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，重组载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体所基于的慢病毒是人类免疫缺陷病毒1(HIV
‑
1)或人类免疫缺陷病毒2(HIV
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2)。
[0014]在一些实施方案中，定量重组载体核酸整合到细胞基因组的方法进一步包括用于鉴定转基因的方法。在一些实施方案中，用于鉴定转基因的方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增生物样品的基因组DNA，其中该引物对的至少一个寡核苷酸引物与转基因特异性杂交；以及(c)检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。在一些实施方案中，转基因是由包含SEQ ID NO:19或21的序列的核酸序列编码的多肽。
[0015]在一些实施方案中，与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于定量重组载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：(a) 提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b) 使用包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物的引物对用定量扩增技术扩增所述生物样品的基因组DNA，其中所述引物对的至少一个寡核苷酸引物与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交；以及(c) 检测和/或定量通过步骤(b)扩增的基因组核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体包含转基因。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因编码嵌合抗原受体。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体是基因疗法载体。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述基因疗法载体是病毒载体。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体是逆转录病毒载体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述慢病毒载体所基于的慢病毒是人类免疫缺陷病毒1（HIV
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1）或人类免疫缺陷病毒2（HIV
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2）。9. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 14的核酸序列。10. 根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于扩增所述重组载体核酸的所述第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 15的核酸序列。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是细胞样品或组织样品。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织样品是血液、血浆、血清、唾液或组织活检。13.根据权利要求1所述的方法，其中与整合的重组载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。14.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区特异性杂交。15.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。16.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考多核苷酸序列进行比较。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量扩增技术是qPCR。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述定量扩增技术是dPCR或ddPCR。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述参考多核苷酸序列编码管家蛋白。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述管家蛋白是人白蛋白。
22.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)利用与所述扩增的重组载体核酸特异性杂交的可检测核酸探针。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述重组载体核酸是慢病毒载体。24. 根据权利要求22所述的方法，其中与所述重组载体核酸特异性杂交的所述探针包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7或SEQIDNO:16的核酸序列。25.根据权利要求22所述的方法，其中用于所述整合的重组载体核酸的所述探针与所述整合的重组载体序列的LTR序列特异性杂交。26.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U3区和R区特异性杂交。27.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的U5区和PBS区特异性杂交。28.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的PBS区特异性杂交。29.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)中使用的与整合的慢病毒载体多核苷酸序列特异性杂交的所述寡核苷酸引物与psi（Ψ）包装信号特异性杂交。30.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(b)中使用的用于所述慢病毒载体核酸的所述探针与所述慢病毒载体核酸序列的5'LTR的R区和U5区特异性杂交。31.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品来自受试者。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述受试者是人。33.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括特异性扩增参考多核苷酸序列的至少一对寡核苷酸引物。34. 一种用于监测重组载体核酸的转导效率的方法，所述方法包括：a)提供了由重组载体核酸转导的包含基因组DNA的一种或多种生物样品，其中所述重组载体核酸的一部分被整合到所述基因组DNA中；以及b)根据权利要求1所述的方法定量整合在所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸。35. 根据权利要求34所述的方法，所述方法进一步包括将所述生物样品的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较。36.一种对由重组载体转导的细胞产物进行批释放测试的方法，所述方法包括a)提供来自每批的由重组载体转导的包含基因组DNA的细胞产物的一个或多个生物样品；b)根据权利要求1所述的方法定量每个生物样品中整合在所述宿主细胞基因组中的所述重组载体核酸；c)将步骤(b)中针对所述生物样品定量的所述整合的重组载体序列拷贝数与参考进行比较；以及d)释放其中所述整合的重组载体序列拷贝数通过预先确定的标准的批。37.一种定量慢病毒载体核酸整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：(a)提供包含宿主细胞基因组的生物样品；(b)使用包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：