The invention discloses a novel oncolytic virus selectively killing prostate cancer cells and its construction method. HSV is obtained by replacing the ICP4 gene promoter on the genome of herpes simplex virus type I 17 + strain with a prostate cancer specific promoter, and then eliminating the ICP34.5 gene on the genome of herpes simplex virus type I 17 + strain and inserting the expression sequence of IL 12.
【技术实现步骤摘要】
一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法
本专利技术涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说是涉及一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。
技术介绍
溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。美国Amgen公司的Ⅰ型单纯疱疹重组病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验中显示出良好的肿瘤治疗效果，并成为首个获得美国FDA批准上市的溶瘤病毒类治疗药物。溶瘤病毒在黑色素瘤治疗上取得的成功引起了科学家对溶瘤病毒疗法更广泛的关注，溶瘤病毒的研究得到了进一步的推动。至今用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpessimplexvirustype1，HSV-1)、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(v...
【技术保护点】
1.一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4‑promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4‑promoter；步骤...
【技术特征摘要】
1.一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker1和Linker2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；步骤二、构建pdICP4-PSA-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人PSA启动子序列从质粒pcDNA3.1-PSA-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-PSA-promoter；步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-PSA-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达PSA启动子的重组病毒载体17-d4-PSA-promoter；步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-PSA-promoter中的PSA-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-PSA-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSVPSA+IL-12。2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭前列腺癌细胞的新型溶瘤病毒构...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁志丰，刘滨磊，刘复兴，吴基良，武倩，
申请(专利权)人：湖北科技学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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