杂交瘤细胞株及其分泌的具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体5E08和分泌该抗体的小鼠抗人单克隆抗体杂交瘤细胞株Anti‑P3(5E08)20170921 CGMCC No.14723，该杂交瘤细胞株是以人BTN3A3与小鼠IgG2a的融合蛋白BTN3A3‑mIg为免疫原免疫小鼠获得，其分泌的单克隆抗体5E08能够阻断LSECtin与BTN3A3之间的相互作用，从而抑制肿瘤的发生与发展。本发明专利技术的单克隆抗体5E08可用于制备抗肿瘤药物，为肿瘤的免疫蛋白治疗提供了一个新思路。

Hybridoma cell lines and their secreted monoclonal antibodies with anti-tumor activity and their application

The present invention discloses a monoclonal antibody 5E08 with anti-tumor activity and a Mouse anti-Human Monoclonal antibody hybridoma cell line Anti_P3(5E08) 20170921 CGMCC No.14723 secreting the antibody. The hybridoma cell line is obtained by immunizing mice with the fusion protein BTN3A3_mIg of human BTN3A3 and mouse IgG2a. The monoclonal antibody 5E08 secreted by the hybridoma cell line can block LSECtin and B. The interaction between TN3A3 inhibits the occurrence and development of tumors. The monoclonal antibody 5E08 of the invention can be used to prepare anti-tumor drugs, and provides a new idea for immunoprotein therapy of tumors.

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及其分泌的具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体与应用
本专利技术属于生物
中的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体与应用，特别是涉及具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体和分泌该抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
全球肿瘤发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。目前，对于肿瘤的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗及中医药辅助治疗等。困扰肿瘤治疗的根本原因是肿瘤具备一定的耐药性及复发能力。研究表明，导致肿瘤具有耐药性以及复发能力的根本原因在于肿瘤细胞干性的维持与提升，因此，肿瘤细胞干性的靶向性治疗日益成为研究的热点。肿瘤细胞的干性受基因多样性、表观遗传以及肿瘤微环境三个因素调控。鉴于肿瘤微环境因素促进肿瘤细胞干性依赖细胞间交互作用，因此，认识并挖掘促进肿瘤细胞干性的膜蛋白相互作用分子对，筛选抑制该类膜蛋白间相互作用的物质，有望为肿瘤细胞干性的靶向性治疗提供新思路。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中存在的巨噬细胞的总称，是肿瘤微环境中浸润免疫细胞的重要组成部分。已有研究显示，肿瘤相关巨噬细胞能够通过多种途径促进肿瘤进程，包括抑制肿瘤免疫反应、促进肿瘤免疫耐受环境的形成、促进肿瘤组织血管生成等。鉴于肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进程现象明确，清除肿瘤相关巨噬细胞、促使肿瘤相关巨噬细胞向免疫激活方向转化已成为潜在的肿瘤治疗方法。LSECtin(LiverSinusoidalEndothelialCellslectin)是Ⅱ型跨膜糖蛋白，位于人类19p13.3，是C型凝集素家族的新成员。已知LSECtin蛋白功能包括在黑色素瘤中负调节T细胞免疫反应，促进埃博拉病毒引发的炎性反应，抑制CTL依赖的HBV病毒清除，促进结肠癌肿瘤细胞肝转移，专利技术人贺福初、唐丽等之前发现LSECtin可能作为黑色素瘤免疫治疗的靶点(CN104906575A，2014100898325)；治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点(CN107019703A，2016100731468)；抗丙型肝炎病毒感染药物作用靶点(CN101152558，2007101755278)；还发现LSECtin或含有LSECtin的融合蛋白可应用于制备抑制癌细胞向肝转移的药物，LSECtin蛋白及其融合蛋白能粘附结肠癌细胞、抑制结肠癌细胞往肝脏的归巢性迁移，成为抗粘附治疗肿瘤肝转移的一个新靶标(CN101732715A，2008102257147)。
技术实现思路
本专利技术旨在提供能够阻断LSECtin与BTN3A3之间相互作用的物质，从而抑制肿瘤的发生与发展(抑制肿瘤进程)。该物质为能够阻断LSECtin与BTN3A3之间的相互作用，具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体。为得到所述具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体，本专利技术首先提出用于制备该抗体的免疫原，其为一种特别设计的融合蛋白，命名为BTN3A3-mIg，是将人BTN3A3与小鼠IgG2a通过连接肽连接后获得的重组蛋白。具体来讲，所述融合蛋白BTN3A3-mIg是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的序列1；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗BTN3A3免疫原性的蛋白质；3)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗BTN3A3免疫原性的蛋白质，新蛋白质与序列1同源性达到80％或更高。其中：序列表中的序列1由499个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1位为起始密码子，第2-15为信号肽，第16-262位为人BTN3A3，自氨基端第263-266位为连接肽(linker)，自氨基端第267-498位为小鼠IgG2a，第499位为终止密码子。编码权利要求上述融合蛋白BTN3A3-mIg的基因，命名为BTN3A3-mIg，也属于本专利技术的保护范围。具体来讲，编码上述融合蛋白的基因BTN3A3-mIg，是下述核苷酸序列之一：1)序列表中序列2的DNA序列；2)编码序列表中序列1的DNA序列；3)与所编码序列表中序列1的DNA序列有一个或几个碱基变化且具有抗BTN3A3免疫原性的的核苷酸序列；4)所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列2且具有抗BTN3A3免疫原性的的核苷酸序列；5)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。其中：序列表中的序列2由1497个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1497位碱基，编码具有序列表中1所示氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端1-3位为起始密码子，自5’端第4-45位碱基编码信号肽，自5’端第46-786位碱基编码人BTN3A3，自5’端第787-798位碱基编码连接肽(linker)，自5’端第799-1494位碱基编码小鼠IgG2a，自5’端第1495-1497位为终止密码子。含有本专利技术融合基因BTN3A3-mIg的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本专利技术的保护范围。扩增融合基因BTN3A3-mIg中任一片段的引物对也在本专利技术的保护范围之内。表达上述融合蛋白BTN3A3-mIg的方法也属于本专利技术。本专利技术所提供的融合蛋白BTN3A3-mIg的表达方法，可包括以下步骤：(1)构建重组表达载体：将融合基因BTN3A3-mIg连接入表达载体中，得到含有融合基因BTN3A3-mIg的重组表达载体；(2)表达融合蛋白BTN3A3-mIg：将含有融合基因BTN3A3-mIg的重组表达载体转化或转染宿主细胞及其后代细胞，培养重组宿主细胞，使融合基因BTN3A3-mIg获得表达；(3)纯化：对重组表达蛋白进行纯化，得到融合蛋白BTN3A3-mIg。在上述融合蛋白BTN3A3-mIg的表达方法中，所述步骤1)中将融合基因BTN3A3-mIg连接入载体pIRES2-EGFP中的NheⅠ和SalⅠ酶切位点之间，得到重组表达载体pIRES2-EGFP-BTN3A3-mIg。所述步骤(2)中的宿主细胞为可表达外源基因的细胞，如293T细胞、293细胞或CHO-S细胞等，优选为293T细胞。所述步骤(2)中培养含有融合基因BTN3A3-mIg的重组宿主细胞的培养基为适于宿主细胞生长的培养基，如无血清培养基M293TI、CDCHO或CDOptiCHOTM等，优选为无血清培养基M293TI。所述步骤(2)中含有融合基因BTN3A3-mIg的重组宿主细胞的培养条件为适于宿主细胞生长的培养条件，如36.5-37.5℃培养24-120小时，优选为37℃培养96小时。所述步骤(3)中可使用如ProteinGSepharose柱(蛋白G琼脂糖凝胶柱)、ProteinA/GSepharose柱(蛋白A/G琼脂糖凝胶柱)、或ProteinASepharose柱(蛋白A琼脂糖凝胶柱)等对重组表达蛋白进行纯化，优选为ProteinGSepharose柱，纯化方法为：将细胞(含有融合基因BTN3A3-mIg的重组宿主细胞)培养上清加入平衡缓冲液(20mMPBS，150mMNaCl，pH8.0)至pH8.0，将细胞上清加入已经用平衡缓冲液平衡好的ProteinGSepharose柱中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.能分泌阻断LSECtin与BTN3A3之间相互作用单克隆抗体的杂交瘤细胞株，是以将人BTN3A3与小鼠IgG2a通过连接肽连接得到的融合蛋白(命名为BTN3A3‑mIg)为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定分泌具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.能分泌阻断LSECtin与BTN3A3之间相互作用单克隆抗体的杂交瘤细胞株，是以将人BTN3A3与小鼠IgG2a通过连接肽连接得到的融合蛋白(命名为BTN3A3-mIg)为免疫原免疫小鼠，获得持续、稳定分泌具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株，其特征在于，所述融合蛋白BTN3A3-mIg是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的序列1；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗BTN3A3免疫原性的蛋白质；3)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抗BTN3A3免疫原性的蛋白质，新蛋白质与序列1同源性达到80％或更高。3.根据权利要求1或2所述杂交瘤细胞株，其特征在于，其名称为小鼠抗人单克隆抗体杂交瘤细胞株Anti-P3(5E08)20170921，保藏编号为CGMCCNo.14723。4.具有抑制肿瘤进程活性的单克隆抗体，由权利要求1或2或3所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，命名为5E08。5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体5E08的重链可变区为：由序列表中序列3氨基酸残基序列表示的多肽、将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与人BTN3A3特异结合的多肽、或与序列表序列3有80％或以上同源性且可与人BTN3A3特异结合的多肽；单克隆抗体5E08的轻链可变区为：由序列表中序列4氨基酸残基序列表示的多肽、将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与人BTN3A3特异结合的多肽、或与序列表序列4有80％或以上同源性且可与人BTN3A3特异结合的多肽。6.根据权利要求4或5所述的单克隆抗体，其特征在于：编码单克隆抗体5E08的基因(5E08)，其重链可变区编码基因为以下之一：具有序列表中序列5的DNA序列、编码序列表中序列3的DNA序列、与所编码序列表中序列3的DNA序列有一个或多个碱基变化的序列、所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列5的序列、和在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；其轻链可变区编码基因为以下之一：具有序列表中序列6的DNA序列、编码序列表中序列4的DNA序列、与所编码序列表中序列4的DNA序列有一个或多个碱基变化的序列、所编码的序列80％或以上同源于序列表中序列6的序列、和在高严谨条件下可与序列表中序列6限...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐丽，贺福初，柳迪，陆倩，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11