高亲和力抗人和肽素的单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种高亲和力抗人和肽素的单克隆抗体及其制备方法与应用，通过将普通免疫与免疫调节分子相结合，在常规普通免疫的同时辅助递送细胞因子Flt3l、mGM‑CSF和CCL20，从而增加免疫动物的免疫反应，提高机体内抗原分子的有效递呈，促进抗体有效成熟，进而得到具有高亲和力的抗体，所得到的抗体亲和力较常规方法制备得到的抗体高10～100倍，可以很好的应用到和肽素免疫检测。

High affinity monoclonal antibodies against human and peptidin and their preparation and Application

The invention provides a monoclonal antibody with high affinity against human and peptide elements and its preparation method and application. By combining common immunity with immunoregulatory molecules, the monoclonal antibody can assist in delivering cytokines Flt3l, mGM CSF and CL20 at the same time of conventional ordinary immunity, thereby increasing the immune response of immune animals, improving the effective presentation of antigen molecules in the body, and promoting the effective maturation of antibodies. The antibody with high affinity is 10 to 100 times higher than the antibody prepared by routine method, which can be well applied to the immunoassay of peptidin.

【技术实现步骤摘要】
高亲和力抗人和肽素的单克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种高亲和力抗人和肽素单克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
和肽素(copeptin)是一种与精氨酸加压素(AVP)同源的包含39个氨基酸残基的多肽，是精氨酸加压素原(pro-VAP)的C端部分肽段。近期研究发现，和肽素作为一项新的生物标识物可以代替AVP，其在心脑血管疾病、糖尿病肾病、脓毒血症及尿路感染等疾病的早期诊断及预后评价方面，有一定的临床应用价值，是一种重要的临床疾病预测因素。目前，针对和肽素的检测主要包括化学免疫发光法和酶联免疫吸附法。两种方法都是基于免疫检测原理的检测技术，检测所用的抗体质量直接关系到检测的灵敏度及特异性，因此，两种方法的检测时间均大于3小时，严重限制了和肽素的临床应用价值。对于多肽抗原诱导开发和肽素单克隆抗体而言，因其自身免疫原性较低，很难引发免疫动物的免疫反应，通常情况下，针对这类免疫原，一般通过偶联载体大蛋白的方式来增强免疫应答。但即便如此，普通的免疫方式也不能很好地提高克隆阳性率，很难开发出高亲和力的和肽素单克隆抗体。目前应用于和肽素免疫检测的抗体仍局限于多抗，多抗本身存在着特异性差的缺点。虽然市场涌现出一些关于和肽素的单抗，但其亲和力一般。若想大大缩短检测时间的同时而又不影响灵敏度，那么开发高亲和的和肽素单抗势在必行。一般情况下，佐剂的作用仅仅在于刺激机体的免疫系统，而对免疫动物机体的免疫力无增强作用。机体的免疫力强弱直接关乎到免疫反应的强弱，而优质单克隆抗体的产生直接取决于免疫动物机体免疫效应的强弱。目前细胞因子在大量DNA免疫法制备单抗的实验中得到应用，并且取得了显著效果。但DNA免疫存在一定的技术难度，操作难度度高，免疫剂量不可控，免疫成本也高。因此，有必要提供一种制备方法，能够制备得到高亲和力抗人和肽素单克隆抗体。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种高亲和力抗人和肽素单克隆抗体及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，即得。在其中一个实施例中，所述人和肽素抗原为含有氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多肽。在其中一个实施例中，所述人和肽素抗原为偶联有大分子蛋白的人和肽素抗原，所述大分子蛋白为KLH、OVA、BSA中的至少一种。优选地，所述人和肽素抗原为C端偶联有KLH的人和肽素抗原。在其中一个实施例中，所述细胞因子包括mFlt3l、mGM-CSF和mCCL20。在其中一个实施例中，所述质粒的载体为pCAGGS。在其中一个实施例中，所述的免疫小鼠为多次免疫，每次免疫后的第6～8天进行一次向小鼠递送表达细胞因子的质粒，每次免疫间隔时间为13～15天；和/或所述的免疫小鼠包括：初次免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，按照每只90～110μg进行小鼠背部皮下多位点注射；第二次免疫：将抗原与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化后，按照每只45～55μg进行小鼠背部皮下多位点注射；其中每次免疫后向小鼠递送表达细胞因子的质粒。优选地，所述免疫小鼠还包括第三次免疫：将抗原与福氏不完全佐剂等体积混合，充分乳化后，按照每只45～55μg进行小鼠背部皮下多位点注射。优选地，融合前3天进行腹腔加强免疫。更优选地，腹腔加强免疫具体包括：用45～55μg抗原稀释于生理盐水，腹腔注射。本专利技术还提供一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞，具体技术方案如下：一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞，由如上所述的制备方法制备得到。本专利技术还提供一种抗人和肽素单克隆抗体的制备方法，具体技术方案如下：一种抗人和肽素单克隆抗体的制备方法，取如上所述的制备方法制备得到的杂交瘤细胞，培养，分泌单克隆抗体，即得。本专利技术还提供一种抗人和肽素单克隆抗体，具体技术方案如下：一种抗人和肽素单克隆抗体，由如上所述的杂交瘤细胞分泌得到，或由如上所述的抗人和肽素单克隆抗体的制备方法制备得到。基于上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的专利技术人无意中发现，相对于普通免疫，将普通免疫与DNA免疫相结合对于免疫反应具有显著的调节作用，同时本专利技术在常规普通免疫的基础上，结合辅助递送表达细胞因子的质粒，从而增加免疫动物的免疫反应，提高机体内抗原分子的有效递呈，促进抗体有效成熟，进而得到具有高亲和力的抗体，所得到的抗体亲和力较常规方法制备得到的抗体高10～100倍，可以很好的应用到和肽素免疫检测中，在保证检测灵敏度的基础上大大缩短了检测时间，从而可有效实现和肽素的POCT应用，增加和肽素的临床应用价值，为重症监护和预后治疗提供更有效的参考指标。附图说明图1为高亲和力抗人和肽素单克隆抗体的制备技术路线；图2为8株稳定的杂交瘤阳性细胞对应制备得到的单克隆抗体凝胶电泳图；图3为实施例1制备得到的高亲和力抗体的效价测定结果图；图4～7为实施例1制备得到的高亲和力抗体的亚型鉴定结果；图8为实施例1制备得到的高亲和力抗体与普通抗体亲和力测定的结果；图9为高亲和力抗体与普通抗体用于细胞免疫组化试验的结果；图10为利用高亲和力抗体基于MPs的全自动化学发光法检测CPP的化学发光标准曲线图。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术的一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，即得。可选地，所述人和肽素抗原为含有氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多肽。优选地，人和肽素抗原为偶联有大分子蛋白的人和肽素抗原，所述大分子蛋白为KLH、OVA、BSA中的至少一种。更优选地，所述人和肽素抗原为C端偶联有KLH的人和肽素抗原。在其中一些实施方式中，所述细胞因子包括mFlt3l、mGM-CSF和mCCL20。优选地，表达细胞因子的质粒为pCAGGS。优选地，所述向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒为：构建可在真核哺乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送免疫的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，即得。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗人和肽素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以人和肽素抗原免疫小鼠；向免疫后的小鼠递送表达细胞因子的质粒；收集经质粒递送免疫的小鼠的脾细胞或淋巴结细胞，并将所述脾细胞或淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人和肽素抗原为含有氨基酸序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多肽。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人和肽素抗原为偶联有大分子蛋白的人和肽素抗原，所述大分子蛋白为KLH、OVA、BSA中的至少一种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子包括mFlt3l、mGM-CSF和mCCL20。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述质粒的载体为pCAGGS。6.根据权利要求1～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的免疫小鼠为多次免疫，每次免疫后的第6～8天进行一次向小鼠递...

【专利技术属性】
技术研发人员：王羽，吴培钿，何小维，康业，黄幼珍，
申请(专利权)人：广州万孚生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44