本发明专利技术公开了一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。所述杂交瘤细胞株命名为G‑1‑1，保藏编号为CGMCC No.16687。本发明专利技术利用自行设计的克仑特罗人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗克仑特罗单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对克仑特罗进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其特别适于动物组织、动物尿液、动物血清、饲料等样本中克仑特罗残留量的检测。
技术介绍
克仑特罗(Clebuterol)属于β-受体激动剂，具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增加酮体瘦肉率、改善肉质以及促进动物生长的作用。然而，在经济利益的驱使下，大量克仑特罗被滥用于畜牧业和养殖业。人体摄入过量克仑特罗时，会导致一系列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼吸加快等，甚至会危害生命。因此，许多国家已经禁止将克仑特罗作为饲料及饲料添加剂使用，我国农业部也于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》。目前，检测克仑特罗比较经典的方法有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)，这些都是比较传统的方法，也是目前的确证方法。基层实验室大批量检测样本应用的一般是免疫方法，因此获得一株具有特异性亲和力的抗克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株是非常重要的。本专利技术制备出一种分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其应用于免疫产品，测定动物组织、动物尿液中克仑特罗药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一株对克仑特罗具有特异性亲和力的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。本专利技术提供一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对克仑特罗具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立克仑特罗总量的免疫学检测方法，包括酶联免疫试剂盒、胶体金检测试纸条、免疫亲和柱等。本专利技术的技术方案：一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为G-1-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.16687。克仑特罗单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.16687的克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株G-1-1所分泌产生。所述的克仑特罗单克隆抗体的应用，用于食品安全中克仑特罗含量的检测。本专利技术提供的细胞株G-1-1的制备步骤为：(1)人工抗原的制备与鉴定：1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)乙醇和琥珀酸酐反应，得到克仑特罗半抗原，半抗原与蛋白质偶联，制备出人工抗原，即免疫原、包被原；(2)单克隆抗体的制备：通过免疫小鼠，得到单克隆抗体；(3)细胞株G-1-1的制备：通过细胞融合和克隆化，得到克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株G-1-1。(4)细胞株G-1-1的应用：应用于酶联免疫试剂盒。(5)细胞株G-1-1的应用：应用于胶体金免疫层析试纸条。(6)细胞株G-1-1的应用：应用于化学发光免疫检测试剂盒、免疫磁珠分离富集试剂盒、磁颗粒化学发光试剂盒、时间分辨荧光免疫层析试纸条、荧光微球免疫层析试纸条、免疫亲和柱等其他免疫检测产品。附图说明图1：克仑特罗半抗原合成路线图具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1克仑特罗试剂盒组分的制备1、克仑特罗半抗原的制备取1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)乙醇1.0g，加20mL吡啶溶解，澄清，加琥珀酸酐0.61g，80℃搅拌5h。停止反应，旋蒸，除去吡啶，得到红色油状物，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/1)洗脱分离，得到琥珀酸酐-克伦特罗类似物1.3g，收率87.84％。2、抗原的制备免疫原制备——克仑特罗半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。取琥珀酸酐-克伦特罗类似物半抗原43mg，加DMF7ml溶解，加EDC39mg，搅拌3h，加NHS28mg，继续搅拌2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)80mg，加4ml0.05mol/LPB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，搅拌24h，0.02mol/LPBS透析三天，得到克伦特罗-BSA免疫原，-20度保存，备用。包被原制备——克仑特罗半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫原。取琥珀酸酐-克伦特罗类似物半抗原21mg，加DMF5ml溶解，加EDC18mg，搅拌3h，加NHS16mg，继续搅拌2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)60mg，加4ml0.05mol/LPB缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，搅拌24h，0.02mol/LPBS透析三天，得到克伦特罗-OVA包被原，-20度保存，备用。3、克仑特罗单克隆抗体的制备动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株。生物材料样品保藏：一株克仑特罗单克隆抗体杂交瘤细胞株G-1-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.16687。保藏日期为2018年10月29日。细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。4、羊抗鼠抗抗体的制备以羊为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。5、酶标记抗抗体的制备将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反应体系中酶与抗体的摩尔浓度比为4:1，由于辣根过氧化物酶在强氧化作用下产生许多与抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体。为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：(1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少；(2)降低辣根过氧化物酶与抗体的摩尔浓度比率至2:1，改良后的方法比传统的方法简便，对酶活性的损失减少。6、酶标板的制备用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例2检测克仑特罗的酶联免疫试剂盒的组建组建检测克仑特罗的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：(1)包被克仑特罗偶联抗原的酶标板；(2)克仑特罗标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L；(3)克仑特罗单克隆抗体工作液；(4)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为G‑1‑1，保藏编号为CGMCC No.16687。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为G-1-1，保藏编号为CGMCCNo.16687。2.制备如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，需要先制备克仑特罗半抗原，半抗原的制备方法如下：取1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)乙醇1.0g，加20mL吡啶溶解，澄清，加琥珀酸酐0.61g，80℃搅拌5h；停止反应，旋蒸，除去吡啶，得到红色油状物，上硅胶柱，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/1)洗脱分离，得到琥珀酸酐-克伦特罗类似物1.3g，收率87.84％。3.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测克仑特罗的酶联免疫试剂盒中的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，贾芳芳，李斌，杜玲，高福勇，陈旭，徐念琴，万宇平，王兆芹，彭正学，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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