处理腺相关病毒的方法及试剂盒技术

本发明专利技术提出了处理腺相关病毒的方法及试剂盒。所述方法包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白‑结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。由此，利用本发明专利技术处理腺相关病毒的方法可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，并且具有操作简便、准确性高、可重复性好、成本低等优点，适于规模化应用。

【技术实现步骤摘要】
处理腺相关病毒的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及处理腺相关病毒的方法及试剂盒。
技术介绍
病毒载体在基因转移和基因治疗中有广泛的应用。其中腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)因具有无致病性、理化性质稳定、免疫原性弱、可定点整合到真核细胞染色体中从而介导外源基因的长期稳定表达等特点而越来越受到关注，在基因转移和基因治疗领域具有广阔的应用前景。然而，目前腺相关病毒的纯化、鉴定及滴度测定方法仍有待研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：超速离心法是最为广泛使用的一种分离AAV的方法，根据杂质与AAV载体的形状、大小以及等密度点的不同，在高速离心作用下实现分离。但不足之处在于操作时间较长，完成2～3次超速离心，需要48～72h，AAV载体长期在黏性或者高渗透压(蔗糖或者CsCl)的溶液中及超速离心的强剪切力作用下，可能会导致载体粒子活力降低；要求操作人员的技术水平要高，若操作不当，则损失严重；在AAV的大规模纯化时，通常需要处理10～200L的细胞裂解液，反复的离心处理，操作烦琐，不利于载体的大规模纯化。色谱柱层析法也是AAV规模化纯化的一种重要方法。当澄清的病毒液流经固定相时，固定相的功能区域与AAV衣壳蛋白或者所含有的基因组相互作用，通过改变流动相的组成或者pH值而实现分离。最常用的方法是肝素亲和层析分离纯化方法，该方法为AAV2最为普遍使用的纯化方法。但是该方法很难用于其他血清型载体。当溶液的pH大于AAV的等电点时，也可以采用阴离子色谱进行分离，如PorosHQ、PorosPI、Source15Q、Q-Sepharose、HiTrapQ等用于纯化AAV1、2、4、5、6、8。但不足之处在于不同血清型的病毒载体理化性质有所差异，因此需要根据不同血清型载体理化特征建立对应的纯化工艺。由此可见，这两大类常用方法均有着其一定的缺陷，限制了规模化的生产。rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。斑点杂交法是AAV滴度测定的传统经典方法，但该方法消耗时间长、定量精确性低、过程复杂、成本比较高、测定结果重现性差，差异可达10倍以上。采用PCR技术检测rAAV基因组序列，可以将测定灵敏度提高10倍，定量PCR技术的运用则又可提高10倍以上。相对于斑点杂交法的2天时间，大大增加了效率，且qPCR法精确度高、操作简单、成本低廉。但作为标准检测方法其重现性不甚理想，并且由于细胞裂解液及培养液中未知成分会抑制PCR反应的进行，大量的DNA和RNA严重干扰PCR测定；生产细胞中含有转基因序列的双链DNA含量要高出rAAV内部包装的单链DNA(目的DNA)1个数量级。如何排除以上干扰，是定量PCR技术能否应用于大规模生产过程质控的关键。有鉴于此，专利技术人采用一种能够特异性结合腺相关病毒的蛋白—腺相关病毒受体，并在该腺相关病毒受体上连接标签蛋白，通过使标签蛋白与结合蛋白特异性结合，以便可以分离出腺相关病毒，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白和结合蛋白复合物。对该复合物可以通过洗脱处理以分离腺相关病毒或者腺相关病毒-腺相关病毒受体复合物，达到纯化、鉴定等目的。同时，还可以对腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物进行滴度检测。由此，利用本专利技术处理腺相关病毒的方法可以达到分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，经纯化的腺相关病毒或者腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物得率及纯度高，可鉴定包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9在内的所有血清型野生及重组AAV，准确性高、操作简单、可重复性好、成本低，适于规模化应用。为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种处理腺相关病毒的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。专利技术人采用一种能够特异性结合腺相关病毒的蛋白—腺相关病毒受体，并在该腺相关病毒受体上连接标签蛋白，通过使标签蛋白与结合蛋白特异性结合，得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白和结合蛋白复合物。由此，可以达到腺相关病毒的分离、纯化、鉴定及滴度检测等目的，并且具有操作简便、准确性高、可重复性好、成本低等优点，适于规模化应用。根据本专利技术的实施例，上述处理腺相关病毒的方法还可以具有下列附加技术特征：根据本专利技术的实施例，所述标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白，优选SBP标签蛋白。根据本专利技术的实施例，所述腺相关病毒受体具有至少3个结构域。根据本专利技术的实施例，所述腺相关病毒选自腺相关病毒1、腺相关病毒2、腺相关病毒3、腺相关病毒5、腺相关病毒6、腺相关病毒7、腺相关病毒8和/或腺相关病毒9。根据本专利技术的实施例，所述结合蛋白选自亲和素。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触，所述固相载体上连接有能够与所述标签蛋白特异性结合的结合蛋白，以便分离出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，得到固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物；以及利用洗脱液对所述固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，以便得到腺相关病毒或者是腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，所述固相载体选自磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶。根据本专利技术的实施例，所述固相载体选自磁珠，所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在50～70℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有0.5质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒；或者所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在90～100℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有1质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；或者所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在室温下孵育40～70分钟，所述洗脱液中含有8～12mM的生物素，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物。根据本专利技术的实施例，基于1mg所述腺相关病毒受体，所述固相载体的添加量为5～20μL。根据本专利技术的实施例，所述固相载体选自链霉亲合素琼脂糖凝胶，所述洗脱液中含有15～30mMTris-HCl和0.5～2mM的NaCl，pH值为7.0～7.8，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将含有腺相关病毒的提取液加入预先包被有腺相关病毒受体的容器中，进行孵育处理，洗板；向所述容器中加入连接有标签蛋白的腺相关病毒受体，进行孵育处理，洗板；向所述容器中加入酶标记的结合蛋白，进行孵育处理，洗板；以及向所述容器中加入显色液，所述显色液与所述酶发生显色反应，对所得到的显色反应液进行光学检测。在本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种处理腺相关病毒的方法，其特征在于，包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒‑腺相关病毒受体‑标签蛋白‑结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。

【技术特征摘要】
1.一种处理腺相关病毒的方法，其特征在于，包括：将腺相关病毒与连接有标签蛋白的腺相关病毒受体接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物；以及将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与结合蛋白接触，以便得到腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白-结合蛋白复合物，其中，所述结合蛋白能够与所述标签蛋白特异性结合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标签蛋白选自Nano标签蛋白、SBP标签蛋白和/或Strep标签蛋白，优选SBP标签蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒受体具有至少3个结构域。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒选自腺相关病毒1、腺相关病毒2、腺相关病毒3、腺相关病毒5、腺相关病毒6、腺相关病毒7、腺相关病毒8和/或腺相关病毒9。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述结合蛋白选自亲和素。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：将所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触，所述固相载体上连接有能够与所述标签蛋白特异性结合的结合蛋白，以便分离出腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，得到固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物；以及利用洗脱液对所述固相载体-结合蛋白-标签蛋白-腺相关病毒受体-腺相关病毒复合物进行洗脱处理，以便得到腺相关病毒或者是腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物，所述固相载体选自磁珠或链霉亲合素琼脂糖凝胶。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述固相载体选自磁珠，所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相载体接触是在50～70℃下孵育5～10分钟，所述洗脱液中含有0.5质量％的SDS，经过所述洗脱处理以便得到腺相关病毒；或者所述腺相关病毒-腺相关病毒受体-标签蛋白复合物与固相...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁卫，崔梦甜，程杉，卢雅彬，张晨光，牛静，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：北京,11