携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术一种携带HPV-16 E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法，是将具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因突变为无致瘤性的E7抗原基因，再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。本发明专利技术的重组腺相关病毒可将其携带的突变型抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明专利技术重组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL可有效地抑制HPV-16E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV-16E7阳性的细胞。该重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗HPV-16感染及其相关的抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】
携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带人乳头瘤病毒16型(HumanPapillomavirusType16，HPV-16)突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其在制备抗HPV-16感染及其相关疾病治疗药物中的应用。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(SamulskiRJ,SrivastavaA,BernsKI,MuzyczkaN.Rescueofadeno-associatedvirusfromrecombinantplasmids:genecorrectionwithintheterminalrepeatsofAAV.Cell.33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(Lip)基因和包膜(Cap)基因(HermonatPL,LabowMA,WrightR,BernsKI,MuzyczkaN.Geneticsofadeno-associatedvirus:isolationandpreliminarycharacterizationofadeno-associatedvirustype2mutants.JVirol.51:329-339.Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和复制蛋白(Rep)基因之间的p5启动子(LabowMA,HermonatPL,BernsKI.Positiveandnegativeautoregulationoftheadeno-associatedvirustype2genome.JVirol.160:251-258.)。AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒包膜(Cap)基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面的缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinantadeno-associatedvirus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中，可制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒。1984年，美国PaulL.Hermonat率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat,P.L.,andMuzyczka,N.Useofadeno-associatedvirusasamammalianDNAcloningvector:transductionofneomycinresistanceintomammaliantissueculturecells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有10余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。2012年11月2日欧盟批准UniQure公司的Glybera产品在欧盟27个成员国使用，这是西方国家第一个获批准的基因治疗药物，它是利用腺相关病毒I型(AAV-1)携带外源基因用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的基因药物。人乳头瘤病毒(HPV)是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。目前至少分离出130多种亚型。根据不同亚型，可分为高危型和低危型。其中对人类危害最大的是高危型，包括HPV-16、18、30、31、33、35、39与宫颈癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌等恶性肿瘤密切相关。其中99％以上的宫颈癌是由高危型HPV引起的，而半数以上的宫颈癌是HPV-16所致。HPV属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，具有致癌作用的E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6、E7编码的癌蛋白E6、E7蛋白分别与抑癌基因p53和Rb结合，引起细胞增殖失控，抑癌基因对DNA的损伤修复功能丧失，导致癌前病变及癌症的发生。据2003-2004年来自美国的国家健康和营养研究课题的一个调查结果显示，14-59岁女性的HPV总感染率为26.8％。中国的HPV感染的流行情况尚未有正式报道，每年约有20万以上的宫颈癌新发现病例，发病率和死亡率有增加趋势，且宫颈癌发病年龄年轻化，可以推测HPV感染率不乐观。但目前尚无确切治愈HPV感染的方法，而现阶段的HPV疫苗有可能预防HPV-16和HPV-18感染，但对于已经感染的人群无效。为达到治愈目的，最理想的治疗是彻底清除受感染的细胞。而受感染的细胞均存在HPV-16E7抗原。因此，HPV-16E7抗原是细胞免疫治疗非常理想的靶子。但是，HPV-16E7抗原是一种致癌蛋白，在宫颈癌等恶性肿瘤的发生中发挥最主要作用之一。因此，在体内和体外用野生型HPV-16E7抗原刺激免疫反应的发生，在安全性方面存在一定风险。因此，必须除去野生HPV-16E7抗原的致瘤性，消除该风险。人树突状细胞(DedriticCells，DC)是人体最重要、也是最主要的抗原提呈细胞。大量的研究已经证明无论在体内还是体外，DC细胞均可诱导或刺激产生具有抗感染和抗肿瘤的细胞免疫反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种携带无致病性(即无致瘤性)的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)突变型E7抗原基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体。本专利技术所提供的rAAV载体，是将剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap并带有AAV的p5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个启动子的AAV载体作为出发载体，将突变型HPV-16E7m94抗原基因插入出发载体中，获得一种全新的rAAV载体，即携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94)。所述AAV载体由本专利申请的专利技术人成功构建，构建方法参见中国专利ZL2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体，是将目的基因突变型HPV‑16 E7m94抗原基因或野生型HPV‑16 E7抗原基因插入腺相关病毒载体中，获得携带HPV‑16 E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV‑16 E7m94)或携带HPV‑16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载体(简称“E7重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV‑16 E7)。

【技术特征摘要】
2014.08.12 CN 20141039578571.一种携带人乳头瘤病毒16型突变型E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体，是将目的基因突变型HPV-16E7m94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入腺相关病毒载体中，获得携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体；所述突变型HPV-16E7m94抗原基因是将HPV-16E7抗原基因的E7抗原蛋白第94位的半胱氨酸(G)改变为甘氨酸(C)对应的基因，即，将HPV-16E7基因开放读码框(nt280)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，获得可以表达无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因；所述HPV-16E7m94基因的核苷酸序列如序列表中序列1。所述腺相关病毒载体为剔除腺相关病毒(AAV)结构基因Rep和Cap的腺相关病毒载体，其携带的启动子为AAVp5启动子、巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子或SV40病毒早期启动子中的任意一个，所述携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体统称为“E7m94重组腺相关病毒载体”或AAV/HPV-16E7m94。所述重组腺相关病毒载体的制备方法，包括以下步骤：1)将HPV-16E7抗原蛋白的第94位半胱氨酸突变为甘氨酸，即将HPV-16E7基因开放读码框(nt280)的胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)，即将编码半胱氨酸的tgt改变为编码甘氨酸的ggt，获得无致瘤性的突变型HPV-16E7m94基因；2)将HPV-16E7m94抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入所述E7m94重组腺相关病毒载体中，得到携带HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体或携带HPV-16E7抗原基因的重组腺相关病毒载体。2.与权利要求1所述重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7m94和重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被所述重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，细胞系包括单核细胞(Monocyte，Mo)和树突状细胞(DendriticCells，DC)。3.制备权利要求2所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7m94相关产品的方法，分别为：携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体质粒的制备：将携带HPV-16E7或HPV-16E7m94抗原基因的重组腺相关病毒载体DNA－AA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇，陈巧林，曾昭鹏，董文娟，孟纱，许艳伟，张慧，卢敬，
申请(专利权)人：广东拓谱康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44