本发明专利技术涉及用于检测基因融合突变的引物/探针组合、试剂盒及其使用方法。其中，所述引物/探针组合包括下组中的至少一种、两种或三种：用于检测ALK基因融合突变的引物/探针组1，所述引物/探针组1包括引物1～8和探针1～2；用于检测RET基因融合突变的引物/探针组2，所述引物/探针组2包括引物9～13和探针3；用于检测ROS1基因融合突变的引物/探针组3，所述引物/探针组3包括引物14～21和探针4～6。本发明专利技术所述引物/探针组合、试剂盒及其使用方法能够实现在单一检测孔中同时检测cfRNA样本中ALK基因9种融合突变，或RET基因4种融合突变，或ROS1基因的9种融合突变，具有特异性好、灵敏度高，检测准确等优点。
【技术实现步骤摘要】
用于检测基因融合突变的引物/探针组合、试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体而言，涉及用于检测基因融合突变的引物/探针组合、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
肺癌是临床常见恶性肿瘤，大量临床研究表明肺癌与基因改变有关。已有证据显示，酪氨酸激酶，例如间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase,ALK)、c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(c-rosoncogene1receptortyrosine,ROS1)以及RET原癌基因(RETproto-oncogene,RET)发生基因融合现象，与肺癌的诊断、预后、治疗效果的判断、靶向药物的开发等相关。在临床和科研上有必要对前述酪氨酸激酶的基因融合进行准确、高效地检测。cfRNA(circulatingcell-freeRNA)是指存在于血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液等体液中的细胞外游离RNA。随着cfRNA分析技术的发展，cfRNA逐渐成为新兴的液体活检分子标记。与传统分子诊断技术相比，基于cfRNA的液体活检能够克服肿瘤的异质性，更全面地反映肿瘤特性，并具有非侵入性，便于多次取样，可对患者进行实时监控等优点。cfRNA越来越多地应用于疾病诊断、治疗监测、预后评估和靶向药物的开发等方面。因此，以cfRNA为检测对象，鉴定前述酪氨酸激酶是否发生基因融合突变具有重要意义。目前的基因融合突变检测方法主要包括染色体显带技术、荧光原位杂交、免疫组化、荧光定量PCR和高通量测序，但不适合基于cfRNA的ALK、ROS1和RET融合基因的鉴定。具体而言，首先，染色体显带技术、荧光原位杂交和免疫组化只能用于检测染色体或组织细胞，不能检测cfRNA。其次，荧光定量PCR需要标准曲线确定待测样本的拷贝数，无法检测到cfRNA中的稀有突变；高通量测序的读长较短，导致测序结果的不准确性，且结果报告周期较长。再者，cfRNA的样本丰度低，半衰期短，增加了检测的难度，同时，ALK涉及9种不同的基因融合突变方式，RET涉及4种不同的基因融合突变方式，ROS1涉及9种不同的基因融合突变方式，进一步增加检测的难度。因此，如何同时实现对ALK基因、RET基因或ROS1基因的多种不同融合方式的检测，进一步如何同时实现ALK基因、RET基因和ROS1基因融合突变的检测(共22种)，存在极大的困难。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供用于检测基因融合突变的引物/探针组合，所述引物/探针组合经过精心设计，其能够基于数字PCR技术，在同一检测孔中同时检测cfRNA中的9种ALK基因融合突变、4种RET融合基因突变或9种ROS1融合基因突变，具有特异性好、灵敏度高、检测结果准确、无创等优点；优选地，所述引物/探针组合包括引物/探针组1、组2和组3，其最佳反应条件接近，能够在同一次数字PCR反应过程中，对前述22种基因融合突变同时进行检测；优选地，所述引物/探针组合还包括引物/探针组4，所述引物/探针组4能够对内参基因HPRT1进行准确检测，提高定量检测结果的准确性。本专利技术的第二目的在于提供一种用于检测基因融合的试剂盒，所述试剂盒包括引物/探针组合。本专利技术的第三目的在于提供前述引物/探针组合或检测试剂盒的使用方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：用于检测基因融合突变的引物/探针组合，所述引物/探针组合包括下组中的至少一种、两种或三种：用于检测ALK基因融合突变的引物/探针组1，所述引物/探针组1包括引物1～8和探针1～2，其中，所述引物1～8的核苷酸序列分别如SEQIDNO.19～20、30～31、23、32、25、27所示，所述探针1～2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.28～29所示；用于检测RET基因融合突变的引物/探针组2，所述引物/探针组2包括引物9～13和探针3，其中，所述引物9～13的核苷酸序列分别如SEQIDNO.33～37所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQIDNO.38所示；用于检测ROS1基因融合突变的引物/探针组3，所述引物/探针组3包括引物14～21和探针4～6，其中，所述引物14～21的核苷酸序列分别如SEQIDNO.39～43、45～46、48所示，所述探针4～6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.44、47、49所示。由基因融合突变产生的cfRNA存在丰度低、片段短、容易降解的特点，其检测难度大，而在同一检测孔中同时对多种融合突变进行检测，涉及多对引物和多重PCR，进一步增加检测的难度。目前，基于cfRNA的融合基因检测方法报道不多，而基于cfRNA同时对基因的多种不同融合方式进行检测的方法尚未见报道。为解决上述技术问题，本专利技术提供前述引物/探针组合，所述引物/探针组合可用于数字PCR，其采用PCR终点检测和泊松分布原理实现核酸样本的绝对定量，与传统PCR检测方法(如荧光定量PCR)相比，其检测的灵敏度高，能够实现在低丰度cfRNA样品中检测基因融合突变。同时，本专利技术根据ALK、RET和ROS1基因融合突变的特点，对引物和探针进行精心设计和优化，最终尽管在同一检测孔中涉及多对引物和多重PCR，但仍然确保其具有高特异性和高扩增效率，实现在同一检测孔中同时检测多种融合突变；进一步地，组1、组2和组3在进行数字PCR反应时，最佳反应条件接近，可以在同一次数字PCR反应过程中，同时对ALK、RET和ROS1基因融合突变进行检测，具有极高的便利性。综上所述，本专利技术所述引物/探针组合具有灵敏度高、特异性强的优点，且检测系统的假阳性及假阴性率显著下降，同时可实现无创检测，其应用前景广阔。在一些具体的实施方式中，所述引物/探针组合还包括用于检测HPRT1基因的引物/探针组4，所述引物/探针组4包括引物22～23和探针7，其中，所述引物22～23的核苷酸序列分别如SEQIDNO.13～14所示，所述探针7的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。在一些具体的实施方式中，所述探针1～2、所述探针3和/或所述探针4～6标记有荧光标记A；优选地，所述探针7标记有荧光标记B，所述荧光标记A与所述荧光标记B不同；更优选地，所述荧光标记A为FAM，所述荧光标记B为VIC。在一些具体的实施方式中，每组中各引物与各探针的摩尔比均为(5～15):(2～3)；优选地，每组中各引物与各探针的摩尔比为4:1。本专利技术还涉及一种用于检测基因融合突变的试剂盒，所述试剂盒包括前述的引物/探针组合。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒还包括其他辅助检测试剂。在一些具体的实施方式中，所述其他辅助检测试剂包括以下一种或者多种：Taq酶、dNTPs、缓冲液、水、阴性质控品和阳性质控品；更优选地，所述Taq酶、dNTPs和缓冲液混合为单试剂。在一些具体的实施方式中，所述缓冲液中包括Tris·Cl、K+和Mg2+；优选地，所述K+由KCl提供，所述Mg2+由MgSO4和MgCl2提供。本专利技术还涉及前述引物/探针组合或试剂盒的使用方法，所述方法包括：(1)使用前述引物/探针组合或试剂盒对样本进行数字PCR反应；(2)根据所述数字PCR的扩增结果，判读样本是否发生基因融合突变。在一些具体的实施方式中，所述数字PCR的反应体系包括：500nM～1500nM引物1～8(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测基因融合突变的引物/探针组合，其特征在于，所述引物/探针组合包括下组中的至少一种、两种或三种：用于检测ALK基因融合突变的引物/探针组1，所述引物/探针组1包括引物1～8和探针1～2，其中，所述引物1～8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19～20、30～31、23、32、25、27所示，所述探针1～2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.28～29所示；用于检测RET基因融合突变的引物/探针组2，所述引物/探针组2包括引物9～13和探针3，其中，所述引物9～13的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33～37所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；用于检测ROS1基因融合突变的引物/探针组3，所述引物/探针组3包括引物14～21和探针4～6，其中，所述引物14～22的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.39～43、45～46、48所示，所述探针4～6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.44、47、49所示。
【技术特征摘要】
1.用于检测基因融合突变的引物/探针组合，其特征在于，所述引物/探针组合包括下组中的至少一种、两种或三种：用于检测ALK基因融合突变的引物/探针组1，所述引物/探针组1包括引物1～8和探针1～2，其中，所述引物1～8的核苷酸序列分别如SEQIDNO.19～20、30～31、23、32、25、27所示，所述探针1～2的核苷酸序列分别如SEQIDNO.28～29所示；用于检测RET基因融合突变的引物/探针组2，所述引物/探针组2包括引物9～13和探针3，其中，所述引物9～13的核苷酸序列分别如SEQIDNO.33～37所示，所述探针3的核苷酸序列如SEQIDNO.38所示；用于检测ROS1基因融合突变的引物/探针组3，所述引物/探针组3包括引物14～21和探针4～6，其中，所述引物14～22的核苷酸序列分别如SEQIDNO.39～43、45～46、48所示，所述探针4～6的核苷酸序列分别如SEQIDNO.44、47、49所示。2.根据权利要求1所述的引物/探针组合，其特征在于，所述引物/探针组合还包括用于检测HPRT1基因的引物/探针组4，所述引物/探针组4包括引物22～23和探针7，其中，所述引物22～23的核苷酸序列分别如SEQIDNO.13～14所示，所述探针7的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。3.根据权利要求1或2所述的引物/探针组合，其特征在于，所述探针1～2、所述探针3和/或所述探针4～6标记有荧光标记A；优选地，所述探针7标记有荧光标记B，所述荧光标记A与所述荧光标记B不同；更优选地，所述荧光标记A为FAM，所述荧光标记B为VIC。4.根据权利要求1～3任一项所述的引物/探针组合，其特征在于，每组中各引物与各探针的摩尔比均为(5～15):(2～3)；优选地，每组中各引物与各探针的摩尔比为4:1。5.一种用于检测基因融合突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的引物/探针组合。6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：张利清，张琴，黄霖霆，曹乾升，李杜衡，张林，任用，
申请(专利权)人：江苏先声医学诊断有限公司，南京先声医学检验有限公司，北京先声医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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