一种兼并引物的设计筛选方法技术

本发明专利技术提供一种兼并引物的设计筛选方法。本发明专利技术所述方法通过多重比对、k‑mer划分、制备兼并k‑mer、获得候选引物集以及组合引物对等步骤，实现对多种物种基因设计兼并引物，并筛选出最佳兼并引物对。

【技术实现步骤摘要】
一种兼并引物的设计筛选方法
本专利技术涉及生物信息学分析领域，特别是涉及一种兼并引物的设计筛选方法。
技术介绍
在临床病原诊断领域，常用检测方法为PCR扩增、16SrRNA测序和宏基因组测序，其中PCR扩增主要面向靶向扩增检测，16S测序物种区分度不足以作病原鉴定，宏基因组测序在解决大量的宿主DNA占比问题上仍有很大的挑战。鉴于常规检测方法中的各种局限和挑战，提供一套临床常见病原菌的靶向检测解决方案尤为重要。病原靶向检测需要富集目标物种特定序列后测序作物种鉴定，达到临床关注病原检测的目的。这就要求富集引物能够覆盖到多种病原物种，且富集序列需具备一定地物种区分度用于后续作物种鉴定分析。靶向富集技术需要在物种序列的保守区设计兼并引物，同时要求富集区间包含一定比例地可变区用于物种区分。靶向富集序列可应用于下一代测序(NextGenerationSequencing，NGS)和纳米孔测序(OxfordNanoporeTechnologies，ONT)。关于靶向富集引物的设计筛选，现有技术主要根据蛋白保守性domain结构作兼并引物设计，该方法需要预知基因对应地蛋白序列，且引物对组合时具有一定地随意性，比较适用于同属相似物种间的引物设计，而对于非相似物种的引物设计并不适用。目前linux端引物设计经常调用primer3软件，但该软件只适用于提供特定序列设计非兼并引物，并不支持兼并引物设计。为推进靶向富集在临床病原检测中的应用，亟需开发一种靶向富集兼并引物的设计筛选方法。有鉴于此，提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种兼并引物的设计筛选方法。考虑到病原靶向检测需要富集目标物种特定序列，然后测序进行物种鉴定，以达到临床病原检测目的，这就要求富集引物能够覆盖到多种病原物种，且富集序列需具备一定地物种区分度用于后续物种鉴定分析。为推进靶向富集在临床病原检测中的应用，本专利技术通过深入挖掘大量多物种序列数据，从物种基因或全基因组多重序列比对结果入手，惊奇发现在多物种基因多重序列比对下，可通过k-mer方法将所有序列划分为k长度的短序列，便于后续对引物设计区域进行筛选。同时为了设计兼并引物，本专利技术还开发了一种碱基转码规则及其反向互补规则，在物种个数等于序列数时，保障了引物设计区域的特异性，对该区域的k-mer进行碱基转码形成兼并k-mer，同时记录其位置信息和反向互补序列，进一步对兼并k-mer以不同引物长度L进行划分，便于筛选最优引物对。基于对此的研究发现，本专利技术构建了一套兼并引物的设计筛选方法，并通过大量多物种兼并引物设计对该方法进行验证，又利用生信、湿实验方法对兼并引物进行特异性验证，结果表明该方法所设计出的兼并引物可以对多物种进行特异性扩增。因此，本专利技术的第一目的是提供一种兼并引物的设计筛选方法。本专利技术的第二目的是提供一种兼并引物的设计筛选产品。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种兼并引物的设计筛选方法，所述方法包括：1)多重比对：物种序列进行多重比对；2)k-mer划分：多重比对序列进行k-mer划分；3)形成兼并k-mer：划分后的多重比对k-mer以满足基础引物设计条件进行筛选，筛选后的k-mer进行同位置的碱基转码，形成兼并k-mer序列F和其反向互补k-mer序列R；4)形成候选引物集合：以不同引物长度L划分步骤3)后的序列，分别形成候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合；5)组合引物对：对候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合中的引物进行两两引物对组合，筛选最优引物对。在一些实施方式中，所述步骤5)中筛选的条件为：兼并碱基最大个数为0-6，优选为4；F与R引物间连续碱基互补最大个数为4-5，优选为4；兼并引物Tm值取值范围为55-70℃，GC含量取值范围40％-60％。在一些实施方式中，所述步骤3)还包括统计碱基转码后k-mer中的兼并碱基占比P，筛选P＜P(max)的k-mer序列；在一些优选的实施方式中，所述P(max)取值范围为20％-30％；更优选地为25％。在一些实施方式中，所述步骤3)中基础引物设计条件为：序列不存在gap，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70℃。在一些实施方式中，所述步骤3)中碱基转码规则为A→A，T→T，C→C，G→G，A/G→R，C/T→Y，A/C→M，G/T→K，C/G→S，A/T→W，A/C/T→H，C/G/T→B，A/C/G→V，A/G/T→D，A/C/G/T→N；转码后的反向互补规则为A→T，T→A，C→G，G→C，R→Y，Y→R，M→K，K→M，S→S，W→W，H→D，D→H，B→V，V→B，N→N；在一些实施方式中，所述步骤5)中兼并引物Tm值计算公式为Tm＝4×(C+G+S+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)/3+(B+V)×2/3)+2×(A+T+W+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)×2/3+(B+V)/3)，兼并引物GC含量计算公式为GC＝(C+G+S+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)/3+(B+V)×2/3)/L。在一些实施方式中，所述步骤2)中所述k-mer，k取值范围为20-38；优选为25。在一些实施方式中，所述步骤4)中所述L取值范围为L(min)≤L≤k；L(min)取值范围为18-21，优选为20。在一些实施方式中，所述步骤5)中所述引物对组合取决于目标扩增区间长度T，T的取值范围为80-5k；优选为1-5k。本专利技术还提供一种兼并引物的设计筛选系统/装置/产品，其特征在于，所述系统/装置/产品包含如下模块：1)多重比对模块：物种序列进行多重比对；2)k-mer划分模块：多重比对序列进行k-mer划分；3)形成兼并k-mer模块：划分后的多重比对k-mer以满足基础引物设计条件进行筛选，筛选后的k-mer进行同位置的碱基转码，形成兼并k-mer序列F和其反向互补k-mer序列R；4)形成候选引物集合模块：以不同引物长度L划分步骤3)后的序列，分别形成候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合；5)组合引物对模块：对候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合中的引物进行两两引物对组合，筛选最优引物对。在一些实施方式中，所述5)组合引物对模块中筛选条件为：兼并碱基最大个数为0-6，优选为4；F与R引物间连续碱基互补最大个数为4-5，优选为4；兼并引物Tm值取值范围为55-70℃，GC含量取值范围40％-60％。在一些实施方式中，所述3)形成兼并k-mer模块还包括统计碱基转码后k-mer中的兼并碱基占比P，筛选P＜P(max)的k-mer序列；优选地，所述P(max)取值范围为20％-30％，更优选地为25％；在一些实施方式中，所述3)形成兼并k-mer模块中，基础引物设计条件为序列不存在gap，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种兼并引物的设计筛选方法，其特征在于，所述方法包括：/n1)多重比对：物种序列进行多重比对；/n2)k-mer划分：多重比对序列进行k-mer划分；/n3)形成兼并k-mer：划分后的多重比对k-mer以满足基础引物设计条件进行筛选，筛选后的k-mer进行同位置的碱基转码，形成兼并k-mer序列F和其反向互补k-mer序列R；/n4)形成候选引物集合：以不同引物长度L划分步骤3)后的序列，分别形成候选k-mer F引物集合和候选k-mer R引物集合；/n5)组合引物对：对候选k-mer F引物集合和候选k-mer R引物集合中的引物进行两两引物对组合，筛选最优引物对。/n

【技术特征摘要】
1.一种兼并引物的设计筛选方法，其特征在于，所述方法包括：
1)多重比对：物种序列进行多重比对；
2)k-mer划分：多重比对序列进行k-mer划分；
3)形成兼并k-mer：划分后的多重比对k-mer以满足基础引物设计条件进行筛选，筛选后的k-mer进行同位置的碱基转码，形成兼并k-mer序列F和其反向互补k-mer序列R；
4)形成候选引物集合：以不同引物长度L划分步骤3)后的序列，分别形成候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合；
5)组合引物对：对候选k-merF引物集合和候选k-merR引物集合中的引物进行两两引物对组合，筛选最优引物对。


2.根据权利要求1所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤5)中筛选的条件为：兼并碱基最大个数为0-6，优选为4；F与R引物间连续碱基互补最大个数为4-5，优选为4；兼并引物Tm值取值范围为55-70℃，GC含量取值范围40％-60％。


3.根据权利要求1-2任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤3)还包括统计碱基转码后k-mer中的兼并碱基占比P，筛选P＜P(max)的k-mer序列；优选地，所述P(max)取值范围为20％-30％，更优选地为25％。


4.根据权利要求1-3任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中基础引物设计条件为：序列不存在gap，GC含量为40％-60％，引物Tm为50-70℃。


5.根据权利要求1-4任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中碱基转码规则为A→A，T→T，C→C，G→G，A/G→R，C/T→Y，A/C→M，G/T→K，C/G→S，A/T→W，A/C/T→H，C/G/T→B，A/C/G→V，A/G/T→D，A/C/G/T→N；转码后的反向互补规则为A→T，T→A，C→G，G→C，R→Y，Y→R，M→K，K→M，S→S，W→w，H→D，D→H，B→V，V→B，N→N；所述步骤5)中兼并引物Tm值计算公式为Tm＝4×(C+G+S+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)/3+(B+V)×2/3)+2×(A+T+W+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)×2/3+(B+V)/3)，兼并引物GC含量计算公式为GC＝(C+G+S+(R+Y+M+K+N)/2+(H+D)/3+(B+V)×2/3)/L。


6.根据权利要求1-5任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中所述k-mer，k取值范围为20-38，优选为25。


7.根据权利要求1-6任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步骤4)中所述L取值范围为L(min)≤L≤k；L(min)取值范围为18-21，优选为20。


8.根据权利要求1-7任一所述的设计筛选方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁相志，周水莲，胡龙，张烨，任用，
申请(专利权)人：江苏先声医学诊断有限公司，北京先声医学检验实验室有限公司，江苏先声医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32