鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。包括由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物序列组成的引物对1，以及由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物序列组成的引物对2。首先提取小管福寿螺或斑点福寿螺的基因组DNA，以此为模板，使用两组特异引物对在普通PCR试剂体系和程序下进行多重PCR反应，通过凝胶电泳检测，确定福寿螺的杂交型。本方法快速而准确，只需一个PCR反应，便可以鉴别多种不同的杂交型，具有较强的可重复性和稳定性。与酶切和序列分析方法相比，该方法简易而经济，无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般技术人员均可操作，是鉴别福寿螺杂交型的理想方法。

【技术实现步骤摘要】
鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种快速精准鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法，属于生物

技术介绍
福寿螺又名苹果螺，隶属于腹足纲，新进腹足目，瓶螺科，福寿螺属(Pomacea)，是世界100种最具威胁的入侵种之一，也是我国首批公布的16种危害极大的外来入侵物种之一。福寿螺原产于南美亚马孙流域，现分布范围广，涉及亚洲、北美洲、欧洲及澳洲的热带、亚热带和温带地域。在我国，福寿螺最早于1981年引入广东中山，迄今已入侵扩散30余年，成为南方水稻种植区的一大灾患。据统计，我国每年有上百万公顷的稻田遭受福寿螺不同程度的危害，水稻单产可减少3～5成，高者可达70％。调研数据表明，福寿螺主要在我国北纬30°以南的地域发生，并以每年8～10千米的速度向北扩散。同时，受气候变化、频繁地种苗调运以及域往来等影响，福寿螺的扩散趋势加剧。当前，福寿螺在我国江苏、浙江、湖南、四川、重庆、江西、云南、贵州、福建、广西、广东，海南等省份均有发生。世界入侵性福寿螺主要包括两种，即小管福寿螺(P.canaliculata)和斑点福寿螺(P.maculata)，国内外研究学者基于母系遗传的线粒体基因并结合成螺的解剖学特征等对两种福寿螺进行了种类的鉴别。然而，近期研究表明，小管福寿螺和斑点福寿螺种间并未形成完全的生殖隔离，两种间正反杂交后均可产生F1代，且F1代可与亲本小管福寿螺回交产生回交代群体。已有报道显示，在亚洲国家如日本、韩国、越南、菲律宾均已检测到杂交种群的分布。种间杂交和遗传渐渗导致福寿螺等位基因的交换，而发生生物学性状的改变。例如，斑点福寿螺比小管福寿螺的抗寒性低，在温带国家的较高纬度地区无法定殖，通过与小管福寿螺种间杂交与遗传渐渗，斑点福寿螺提升了抗寒性，扩大了其入侵范围。因而，福寿螺种类中的杂交群体的准确鉴别，将为分析福寿螺进化潜力和发展动态提供理论基础，同时可为制定有效的福寿螺防治策略提供科学依据。然而，基于形态特征难以实现福寿螺杂交种的鉴别。现有的福寿螺杂交检测方法主要有两种。一种方法是通过对检测样品EF1α基因片段进行克隆测序，经序列比对后构建系统发育树，根据系统发育关系进行鉴别。该方法通过克隆测序不仅实验步骤繁琐，测序成本高，而且耗时约需5天，不适合大量样本的检测。另一种方法是一种结合PCR和限制性内切酶酶切的技术，进行杂交型的鉴别。其具体操作为对待测样品核EF1α基因片段进行PCR扩增，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，通过电泳图谱判别。该方法检测约需4～5小时，然而酶切操作易污染，容易出现假阳性，检测的精准度不高。从上述例子可以看出，虽然目前已有一些检测两种福寿螺杂交型的方法和技术，但是尚有不足之处，如检测步骤繁琐，耗时长，精准度不高，检测成本昂贵等。上述这些严重影响了外来入侵福寿螺杂交种群的准确快速鉴别。针对如上情况，有必要建立一套快速精准鉴别小管福寿螺和斑点福寿螺杂交型的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种用于鉴别或辅助鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。本专利技术所提供的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，包括如下两对引物对：(1)由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物序列组成的引物对1；(2)由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物序列组成的引物对2。较为优选的，所述试剂盒中组成两个引物对的四条引物的摩尔数相等。所述福寿螺为小管福寿螺、斑点福寿螺。所述引物对1特异于小管福寿螺的鉴别；所述引物组2特异于斑点福寿螺的鉴别。优选的，所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。本专利技术的再一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。所述试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：将组成所述试剂盒中各引物对的各单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。本专利技术还公开了一种福寿螺杂交型的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：(a)以待测福寿螺的基因组DNA为模板，用引物对1和引物对2进行PCR扩增；(b)检测步骤(a)得到的PCR产物的数量及大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测福寿螺的杂交型：若所述PCR产物中含有且仅含有一条125bp的DNA片段，则所述待测福寿螺为小管福寿螺纯合型；若所述PCR产物中含有且仅含有一条151bp的DNA片段，则所述待测福寿螺为斑点福寿螺纯合型；若所述PCR产物中含有两条DNA片段，长度分别为125bp和151bp，则所述待测福寿螺为小管福寿螺和斑点福寿螺的杂合型。所述步骤(a)进行PCR扩增的退火温度优选为56℃。优选的，所述引物对1和引物对2中的四种引物在PCR反应体系中的摩尔比为1:1:1:1。所述125bp的DNA片段序列如SEQIDNO.5所示；所述151bp的DNA片段序序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术是在小管福寿螺和斑点福寿螺这两种世界入侵性福寿螺的核基因EF1α序列的基础上，设计并筛选出识别两种福寿螺的特异引物对，形成基于特异引物方法的多重PCR鉴别试剂盒，实现世界入侵性福寿螺杂交型的准确鉴别。本专利技术所提供的基于特异引物鉴别外来生物福寿螺的试剂盒，不仅特异性强、灵敏度高，而且具有较高的可重复性和稳定性，是鉴别福寿螺杂交型的理想方法。附图说明图1为本专利技术的多重PCR试剂盒对质粒扩增的特异性检测结果。其中泳道M为DNA相对分子量标准(50bpDNAladder)；其他泳道信息为1：仅插入有小管福寿螺的EF1α序列的质粒DNA；2：仅插入有斑点福寿螺EF1α序列的质粒DNA；3：人工等比例混配的仅插入有小管福寿螺EF1α序列的质粒DNA与仅插入有斑点福寿螺EF1α序列的质粒DNA组成的杂交型质粒DNA；CK为以ddH2O为阴性对照。图2为本专利技术的多重PCR试剂盒对小管福寿螺和斑点福寿螺的杂交型检测结果。其中，泳道M为DNA相对分子量标准(50bpDNAladder)；其他泳道信息为1～9为不同地理种群的小管福寿螺基因组DNA；10～15为不同地理种群孤岛福寿螺基因组DNA；CK为以ddH2O为阴性对照。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。两种外来入侵福寿螺：小管福寿螺和斑点福寿螺。其中，小管福寿螺涉及如下地理种群：浙江绍兴种群、湖南长沙种群、云南昆明种群、广东广州种群、广西桂林种群、广东揭阳种群、云南大理种群、浙江舟山种群、浙江杭州种群；斑点福寿螺涉及如下地理种群：四川遂宁种群、四川成都种群、重庆合川种群、浙江杭州种群、重庆沙坝种群。以上两种福寿螺记载在“周晓农,张仪,吕山.福寿螺学名中译名的探讨.中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2009,27(1):62-64.”一文中。实施例1、针对两种福寿螺EF1α序列的特异引物的设计与合成一、两种福寿螺EF1α序列的获得实验材料：小管福寿螺和斑点福寿螺两种外来入侵福寿螺。其中，小管福寿螺涉及如下地理种群：浙江绍兴种群、湖南长沙种群、云南昆明种群、广东广州种群、广西桂林种群、广东揭阳种群、云南大理种群、浙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括如下两对引物对：(1)由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物序列组成的引物对1；(2)由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示引物序列组成的引物对2。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括如下两对引物对：(1)由SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示引物序列组成的引物对1；(2)由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物序列组成的引物对2。2.根据权利要求1所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中组成两个引物对的四条引物的摩尔数相等。3.根据权利要求1或2所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述福寿螺为小管福寿螺、斑点福寿螺。4.权利要求1所述的鉴别福寿螺杂交型的多重PCR检测试剂盒，其特征在于还包括PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。5.一种福寿螺杂交型的多重PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：(a)以待测福寿螺的基因组DNA为模板，用引物对1和引物对2进行PCR扩增；(b)检测步骤(a)得到的P...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩倩，俞晓平，张蓬军，刘光富，贺超，刘苏汶，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33