本发明专利技术属于畜禽抗病毒微生态制剂技术领域，具体公开了植物乳杆菌ZN‑3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用。本发明专利技术中的植物乳杆菌菌体或发酵上清液，均能在一定程度上降低PEDV病毒对宿主细胞的感染活性，抑制PEDV病毒入侵对细胞的感染，本发明专利技术中植物乳杆菌ZN‑3菌体悬液的3种处理方式都对病毒有直接抑制作用；对于植物乳杆菌ZN‑3发酵上清，先加发酵上清后加PEDV稀释液、同时加发酵液和PEDV稀释液2种方式对病毒也有直接抑制作用，抑制率分别为32.08%、13.21%。植物乳杆菌菌体或pH7.0发酵上清液，对细胞无毒副作用，可有效用于预防和治疗猪的流行性腹泻。
Application of Lactobacillus plantarum ZN-3 in preparation of * drugs for treatment or prevention of porcine epidemic diarrhea virus infection
The invention belongs to the technical field of the antiviral microecological preparation of livestock and poultry, and discloses the application of Lactobacillus plantarum ZN * 3 in the preparation of drugs for the treatment or prevention of porcine epidemic diarrhea virus infection. The Lactobacillus plantarum or fermentation supernatant in the invention can reduce the infective activity of PEDV virus to host cells to a certain extent, and inhibit the infection of PEDV virus invasion to cells. The three treatment methods of Lactobacillus plantarum ZN_3 suspension in the invention have direct inhibitory effect on the virus; for Lactobacillus plantarum ZN. 3. Fermentation supernatant, first adding fermentation supernatant and then adding PEDV dilution solution, at the same time adding fermentation liquid and PEDV dilution solution, also had direct inhibitory effect on virus, the inhibition rates were 32.08% and 13.21%, respectively. Lactobacillus plantarum or pH7.0 fermentation supernatant has no toxic side effects on cells, and can be effectively used to prevent and treat swine * s epidemic diarrhea.
【技术实现步骤摘要】
植物乳杆菌ZN-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用
本专利技术涉及畜禽抗病毒微生态制剂
，特别涉及植物乳杆菌ZN-3在制备治疗及预防猪流行性腹泻病毒感染中的应用。
技术介绍
肠道疾病是现代养猪业中普遍存在的问题，而腹泻类疾病在仔猪阶段比较易发，包括细菌性腹泻、病毒性腹泻，营养性腹泻、以及寄生虫引起的腹泻，其中病毒性腹泻发生率高、传播快、传播范围广、死亡率高，治疗效果不明显，主要以预防为主。特别是2010年至今不断爆发的猪流行性腹泻病毒(PEDV)，流行性腹泻是一种急性高度传染性疾病，主要表现出腹泻、呕吐、脱水等临床症状，在部分规模化猪场死亡率高达80％以上，是引起新生仔猪肠炎和死亡的重要原因，给养殖业造成重大的经济损失。对于疾病来说，一般预防效果会好于治疗效果，特别是病毒性疾病，PEDV也不例外，PEDV具有严格的细胞趋性和宿主特异性。然而，由于病毒的遗传变异，有效的疫苗保护受到影响；抗病毒药物通常有严重的毒副作用，使用量和效果有限。因此，需要不断寻求可控制病毒性疾病的有效方法，益生菌因其无毒、无抗药性、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全的优点受到广泛关注。乳酸类益生菌已被广泛用于预防及治疗人和动物胃肠道紊乱性疾病。乳酸菌能够耐受机体胃肠道酸碱环境，多为厌氧或兼性厌氧菌，能够在肠道上皮细胞定植。乳酸菌还可以产生乳酸，降低肠道内pH，抑制沙门氏菌、大肠杆菌等有害菌的入侵。Giang等(2010)在断奶仔猪日粮中添加屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌复合微生态制剂，与未添加空白对照组比较仔猪腹泻发生率下降。乳酸杆菌口服疫苗的作用效果也得到一些研究结果的证实，已有资料显示乳酸菌不仅有抗菌活性，还具有抗病毒活性。粘膜是许多细菌和病毒入侵感染机体的最主要途径，因此，粘膜免疫在预防这类感染中具有重要作用。通过粘膜途径的口服疫苗能够有效诱导机体潜在的体液免疫和粘膜免疫，是应对这类疾病的有效策略。研究报道(VanNiel等2002；张等2008)嗜酸乳杆菌能够作为轮状病毒疫苗的口服佐剂增强疫苗免疫效果。Kritas和Morrison(2007)也报道口服乳酸杆菌可以提高疫苗对PRRSV病毒感染的保护效率，而且可以提高已感染PRRSV猪的日增重。WangXN等(2017)使用干酪乳杆菌作为抗PEDV的口服疫苗载体，结果表明干酪乳杆菌能够有效诱导机体的粘膜免疫、体液免疫、Th2类型细胞免疫，预防PEDV对机体的感染及发病。此外，益生菌作为口服疫苗具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点。这些资料均证明，益生菌能够促进肠道黏膜免疫，可以作为预防和治疗肠道疾病的制剂，但是关于益生菌直接抗病毒活性的研究还处于起步阶段，特别是非基因工程改造的野生型菌株的抗病毒活性鲜有报道，关于植物乳杆菌对PEDV的抗病毒活性效果目前更是没有研究，本专利技术旨在通过研究获得对猪流行性腹泻病毒(PEDV)有抗病毒活性的益生菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了植物乳杆菌ZN-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用，植物乳杆菌ZN-3可通过消化道进入肠道，抑制肠道病毒PEDV的入侵和增殖，有效预防和治疗流行性腹泻病毒引起的疾病。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：植物乳杆菌ZN-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用，包括利用植物乳杆菌ZN-3制备成流行腹泻病毒(PEDV)的抑制剂，或是制备成流行腹泻病毒(PEDV)感染的治疗药物或是预防药物；以上所述的植物乳杆菌ZN-3的保藏编号为：CCTCCNO：M2017286。以上所述的应用中，所述的植物乳杆菌ZN-3包括植物乳杆菌ZN-3发酵液或发酵上清液。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术中用益生菌植物乳杆菌ZN-3进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)对细胞感染，植物乳杆菌作为潜在的抗病毒微生态制剂与传统的抗病毒化学药物相比较具有如下优点：1、无毒副作用、无残留、抗菌、抗病毒、促生长、绿色安全。2、具有使用方便、安全、无免疫应激、经济效益高等优点3、通过消化道进入肠道，抑制肠道病毒PEDV对细胞的入侵和增殖，有效预防和治疗流行性腹泻病毒引起的疾病。本专利技术中植物乳杆菌ZN-3菌体悬液的3种处理方式都对病毒有直接抑制作用，抑制率分别为28.30％、20.75％、22.64％；对于植物乳杆菌ZN-3发酵上清，先加发酵上清后加PEDV稀释液、同时加发酵液和PEDV稀释液2种方式对病毒也有直接抑制作用，抑制率分别为32.08％、13.21％。4、本专利技术中的植物乳杆菌菌体或pH7.0发酵上清液，对细胞无毒副作用，且均能在一定程度上降低PEDV病毒对vero细胞的感染活性，抑制PEDV病毒对细胞的入侵和感染，预防和治疗猪的流行性腹泻。5、益生菌的应用已经有十几年，虽然在临床上对消化道疾病的疗效已经得到一定程度的证实，而且益生菌对免疫功能的保护和增强作用及抗病毒作用也愈加受到关注，但其作用机理尚不清楚，本专利技术从细胞水平阐述益生性植物乳杆菌对流行腹泻病毒(PEDV)的抑制作用。附图说明图1为PEDV病毒在VERO细胞上增殖及病变示意图；其中，左图：未感染PEDV细胞对照，右图：感染PEDV形成的病变。图2为PEDV扩增病毒液PCR检测示意图；其中，1号泳道为阳性对照；2、3、4号泳道为不同胰酶浓度(0、5、10ug/ml)增殖PEDV病毒样品；5号泳道为阴性对照；6、7、8为2、3、4样品重复；9号泳道为Maker。图3为PEDV在96孔板TCID50测定中病变细胞与对照细胞示意图；其中，左图：对照细胞；右图：病变细胞。图4为植物乳杆菌对PEDV病毒的抑制作用示意图；其中，左上图：正常对照细胞；右上图：先加ZN-3后加PEDV稀释液组；左下图：先加PEDV稀释液后加ZN-3组；右下图：病毒对照组。具体实施方式本专利技术实施例中试验方法和条件如无特别说明，均为常规方法。这些实施例仅用于说明本专利技术，本专利技术的保护范围不受这些实施例的限制。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：植物乳杆菌ZN-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用：(1)细胞培养：VERO细胞用10％FBS的DMEM培养48小时左右传代；细胞传代：传代时用0.25％的胰酶消化，约10分钟左右即可消化下来。具体步骤如下：贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液，用PBS溶液洗去残留的旧培养基；向瓶内加入1-2ml消化液(0.25％胰酶)轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终止消化(吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终止消化)；用移液管吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液；计数，分装到新培养瓶中，并补加一定量的含血清的新鲜培养液；盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。(2)PEDV病毒增殖：将消化好的Vero细胞接T75细胞培养瓶，放37℃5％CO2恒温培养箱培养至长出单层细胞；将-80℃保存的PEDV病毒液(CV777)0.1ml接种到本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.植物乳杆菌ZN‑3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用，所述植物乳杆菌ZN‑3的保藏编号为：CCTCC NO：M 2017286。
【技术特征摘要】
1.植物乳杆菌ZN-3在制备治疗或预防猪流行性腹泻病毒感染的药物中的应用，所述植物乳杆菌ZN-3的保藏编号为：CCTCCNO：M2017286。2.植...
【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，杨丽，滑亚锋，康超，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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