本发明专利技术公开了Rv1773c在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术首次确定了结核分枝杆菌功能性蛋白Rv1773c可以促进结核分枝杆菌侵入巨噬细胞。Rv1773c可作为抗结核感染的新的药物靶标。本发明专利技术成果可为临床结核病的预防和治疗提供新的工具和思路，尤其在抗结核药物和疫苗的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发抑制结核分枝杆菌侵入宿主巨噬细胞的抑制剂。本发明专利技术对获得抗结核新的药物靶点和筛选新药具有重要的应用价值。
Application of Rv1773c in the preparation of drugs against Mycobacterium tuberculosis infection
The invention discloses the application of Rv1773c in the preparation of anti-Mycobacterium tuberculosis infection drugs, belonging to the field of biotechnology. It is the first time that the functional protein Rv1773c of Mycobacterium tuberculosis can promote the invasion of Mycobacterium tuberculosis into macrophages. Rv1773c can be used as a new drug target for anti TB infection. The results of the invention can provide new tools and ideas for the prevention and treatment of clinical tuberculosis, especially in the development and clinical application of anti-tuberculosis drugs and vaccines, and have broad prospects, and can also be directly applied to the scientific research field or guide the development of inhibitors to inhibit the invasion of Mycobacterium tuberculosis into host macrophages. The invention has important application value for obtaining new targets and screening new drugs for anti tuberculosis.
【技术实现步骤摘要】
Rv1773c在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及结核分枝杆菌致病蛋白Rv1773c作为设计、筛选抗结核药物的重要靶标位点在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
技术介绍
结核病是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，结核分枝杆菌所致结核病是人畜共患的结核病。全球目前有近三分之一的人感染结核分枝杆菌，据WHO《2016全球结核报告》估计2015年新发结核病例1040万例，因结核病死亡人数达140万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国结核病患病人数居世界第三位。结核多重耐药患者数目增长非常迅速，数据显示，2012年全球新感染多重耐药结核的患者基本上已达到了45万例。如此庞大的数据告诉我们，治疗结核病迫在眉睫。现临床上为了避免药物治疗期间耐药性的出现，多采用抗结核药物联合用药的给药方案，但也无疑加重了患者的负担。近年来，AID的流行以及TB疫情的回升，加之MTB耐药性不断产生，使得医生与患者对于更为高效、更具挑战力的新型抗结核药物的需求更加迫切。因此发掘抗结核感染的新靶标和研发新型抗结核药物已成为目前最受关注的问题。巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的主要宿主细胞。部分结核分枝杆菌可逃避宿主免疫系统、尤其是巨噬细胞的追杀，在被吞噬到巨噬细胞的吞噬体以后，能够成功阻止吞噬体与溶酶体的融合，抑制吞噬溶酶体的成熟，从而阻止了自身被溶酶体降解，同时也可将巨噬细胞作为容身之所，使得自身可以潜伏甚至有条件增殖。鉴定并解析结核分枝杆菌的致病性基因，尤其是与入侵寄主巨噬细胞过程相关的功能基因，可以为设计、筛选抗结核药物提供重要的靶标位点。采用分子生物学技术，克隆及鉴定新的在结核菌侵染过程中发挥重要功能的致病基因，可为设计与筛选新型结核药剂提供重要的药物靶点，这对结核病的综合防治具有十分重要的理论意义和应用价值。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种能显著调控并促进结核分枝杆菌侵入宿主巨噬细胞的结核分枝杆菌致病性蛋白Rv1773c，Rv1773c可作为抗结核感染的新的药物靶标。为实现上述目的，本专利技术技术方案如下：本专利技术的第一方面，提供Rv1773c在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用，所述Rv1773c是结合分枝杆菌RD14区的功能性蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，上述应用中Rv1773c是作为药物筛选的靶点，筛选抑制Rv1773c基因表达，从而抑制结核分枝杆菌侵入宿主巨噬细胞的药物。本专利技术的第二方面，提供Rv1773c的抑制剂在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。本专利技术通过设计H37RvRD10-16区引物，扩增出相应的基因，将其构建至pMV261原核表达载体上，成功构建18个重组pMV261质粒，将重组pMV261质粒电转至耻垢分枝杆菌(M.s)中，将这些重组耻垢分枝杆菌(rM.s::Rvs)感染RAW264.7巨噬细胞30分钟，庆大霉素去除并杀死细胞外未入侵的细菌，将洗后的细胞裂解，裂解液涂布于Kan抗性固体培养基上进行菌落计数。结果揭示菌落数较多的有rM.s::Rv2652、rM.s::Rv1964、rM.s::Rv1773c，经重复验证(n〉3)rM.s::Rv1773c重复性高，菌落数一直保持最多，与对照组相比，结果有统计学意义。因此，筛选出能促进结核分枝杆菌对巨噬细胞侵入的功能性基因Rv1773c。通过流式细胞术法进一步验证rM.s::Rv1773c的抗巨噬细胞杀伤效应。并在动物模型中验证了Rv1773c基因促进细菌感染的效应。因此，结核分枝杆菌Rv1773c基因能够作为药物筛选的靶标，抑制Rv1773c基因表达的药物可用于抑制结核分枝杆菌侵入宿主巨噬细胞，抵抗结核分枝杆菌的感染。本专利技术的有益效果：本专利技术为防治结核病提供了一个重要的靶标基因或靶标蛋白。本专利技术对于揭示结核菌致病性蛋白对结核菌侵入宿主巨噬细胞有重要意义，以该基因或蛋白作为靶标研制的药物，可抑制结核菌侵入宿主巨噬细胞，控制结核菌的致病性。本专利技术成果可为临床结核病的预防和治疗提供新的工具和思路，尤其在抗结核药物和疫苗的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发抑制结核分枝杆菌侵入宿主巨噬细胞的抑制剂。此外，该成果还对寻找新的药物靶点和筛选新药具有重要的理论意义。附图说明图1Rv1773c在不同分枝杆菌中的表达。H37Rv：结核分枝杆菌标准株，M.s：耻垢分枝杆菌，H37Ra：结核分枝杆菌减毒，M.intracellulare：胞内分枝杆菌，M.avium：鸟分枝杆菌，M.marinum：海洋分枝杆菌，BCG：卡介苗，Notemplatecontrol：无模板对照。图2体外菌落计数验证Rv1773c能促进细菌对巨噬细胞的侵入。图3流式细胞法验证rM.s::Rv1773c和rM.s::pMV261入侵巨噬细胞的能力。A-CFCM显示，APC-Rhodamine-,APC+Rhodamine-,APC-Rhodamine+,APC+Rhodamine+的RAW264.7巨噬细胞的比率；D图柱状图定量分析APC-F4/80+Rhodamine+双阳性巨噬细胞在M.s、rM.s::pMW261和rM.s::Rv1773c中的百分率。图4.小鼠分别感染M.s,rM.s::pMV261,rM.s::Rv1773c1天、3天后脾脏的菌落计数结果。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。如无特殊说明，以下实施例中所使用的实际均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。【实施例1】M.tbRD10-16区18个ORF的重组表达质粒和重组分枝杆菌的构建及鉴定提取H37Rv基因组，设计H37RvRD10-16区引物(表1)，扩增出相应的基因，具体步骤如下：利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取H37Rv基因组，作为PCR反应的模板。RD10-16区基因的PCR体系及流程：引物P1和P2各1μL(浓度均为10μM)，基因组DNA1μL(浓度为105ng/μL)，2×Mix25μL，加无菌去离子水至终体积50μL。PCR扩增条件为：在TaqDNA聚合酶的作用下，95℃预变性4min；95℃变性20s，58℃退火30s(此步温度根据各基因引物退火问题酌情微调)，72℃延伸30s共30个循环；最后72℃延伸4min。1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，并用胶回收试剂盒回收和纯化。将其构建至pMV261原核表达载体上，将回收的PCR产物和pMV261空载分别双酶切，酶切产物经凝胶回收试剂盒回收后，利用T4DNAligase连接酶连接产物。将连接产物用热休克法转化入EcoliDH5α感受态细菌，转化产物涂布LB固体培养基(含卡那霉素50μg/mL)。37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，分别接种LB培养液(含卡那霉素50μg/mL)，37℃振荡培养12-16h。保存菌种后，质粒小量提取试剂盒提取质粒并酶切鉴定。并进行酶切鉴定及测序。鉴定及测序成功后将重组pMV261质粒电转至M.s中。成功构建18个重组pMV261质粒，双酶切鉴定成功，测序结果显示序列正确。将重组pM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Rv1773c在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用，所述Rv1773c是结核分枝杆菌RD14区的功能性蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.Rv1773c在制备抗结核分枝杆菌感染的药物中的应用，所述Rv1773c是结核分枝杆菌RD14区的功能性蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓联，刘伟香，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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