同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒，其检测引物组包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对。本发明专利技术建立一种多重PCR检测方法及试剂盒，利用设计得到的所述引物组，对待测样品中提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有上述致病弧菌，具有快速准确、成本低、特异性和灵敏度高的优点。

Simultaneous detection of four kinds of pathogenic Vibrio by multiplex PCR primers, detection methods and kits

The invention discloses a multiplex PCR primer group and a detection method and a kit for simultaneously detecting four pathogenic vibrios. The detection primer group comprises primer pairs for detecting Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Vibrio fluvialis and Vibrio eel. The invention establishes a multiplex PCR detection method and a reagent kit, uses the designed primers group to treat the genomic DNA of the bacteria extracted from the test sample, carries out multiplex PCR reactions in the same reaction system, and determines whether the samples contain the above pathogenic Vibrio by electrophoresis analysis of the reaction products, which is quick and accurate. It has the advantages of low cost, high specificity and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒
本专利技术属于微生物检测领域，涉及同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测引物组、检测方法及试剂盒。
技术介绍
弧菌(Vibrio)是海洋环境中常见的优势细菌菌群之一，菌体短小，兼性厌氧，嗜碱生长，因弯曲如弧而得名，是一类尾部带单鞭毛或者周身鞭毛的革兰氏阴性菌，广泛分布在海湾、河口、半咸水、沉积物以及海洋生物体表和肠道。世界卫生组织根据细菌的DNA同源性、抗原性、生化特性和致病性等将弧菌分为四类：O1群霍乱弧菌、非O1群霍乱弧菌、不典型O1群霍乱弧菌和其他弧菌。弧菌种类繁多，自1854年FilippoPacini首次将从霍乱病人中分离出的微生物命名为弧菌以来，海水养殖强度的不断增大、细菌分类学的日益完善使得该属不断扩编。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)》的叙述，现已有37种弧菌被收录在册，其中有12种被认定为对人类具有致病性的同时也是海洋生物的重要致病菌，包括霍乱弧菌(V.cholera)，溶藻弧菌(V.alginolyticus)，鲨鱼弧菌(V.carchariae)，辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)，美人鱼弧菌(V.damsel)，河流弧菌(V.fluvialis)，弗氏弧菌(V.furnissii)，霍利斯弧菌(V.hollisae)，麦氏弧菌(V.metschnikovii)，拟态弧菌(V.mimicus)，副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)以及创伤弧菌(V.vulnificus)。霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者，主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌，从而患者出现上吐下泻，泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌。溶藻弧菌是一种常见的海洋致病菌，在世界各地海水及河口处广泛分部，并且其数量居海水类弧菌之首，因其生物学性状有许多与副溶血性弧菌相似，在Bergey氏细菌学鉴定手册第八版中将其列为副溶血性弧菌的一个生物型，第八版以后溶藻弧菌又单独立种。溶藻弧菌可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病，同时，它也是鱼、虾、贝等海水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发，特别当水温在25-32℃下容易流行，因此养殖动物的溶藻弧菌病多发生在夏季，爆发时往往会造成水产养殖业巨大经济损失。河流弧菌是生活在海洋里的一种条件致病菌。由于该病原菌的适应能力比较强，海水的温度、盐度、pH等都较适于河流弧菌的生长，所以广泛分布在海洋环境中。近几年，该菌已引起多种水产动物的败血症、脓疱病等疾病，造成了非常严重的经济损失。河流弧菌不仅是多种水产动物的致病菌，而且也是人类的致病菌，是因食用不洁海产品而导致流行性腹泻的主要致病菌。鳗弧菌被认为是造成波罗的海鳗鱼红瘟的罪魁祸首，成为较早发现的海洋细菌病原菌之一，鳗弧菌会导致多种具有经济价值的鱼类包括太平洋和大西洋鲑鱼、虹鳟鱼、大比目鱼、石斑鱼、海狸、条纹鲈、鳕鱼、香鱼和日本、欧洲鳗鱼等患上出血性败血症，并伴有鳍片出血、眼球突出、角膜混浊和真皮水肿等症状，在O1到O23二十多种不同血清型的鳗弧菌中，O1和O2最为常见且毒力最大，由鳗弧菌造成的弧菌病曾给鲈形目和鲑科鱼的海水养殖带来毁灭性的打击。目前，弧菌的检测与鉴定主要有以下几种方法：1、传统的生理生化鉴定迄今为止，国内仍以传统的微生物学生理生化鉴定方法作为致病性弧菌的国家与行业标准检测方法。传统的表型鉴定技术需要针对病原菌的形态、生理、生化特点进行一系列鉴定工作包括选择平板分离、生化试验、神奈川试验等，周期较长，工作量大，操作繁琐，耗时耗力，不利于致病菌的快速检测鉴定。近年来问世的VITEK系列全自动快速微生物鉴定智能分析系统和API20E生化鉴定试剂条因其快速简便准确等优点受到越来越多的青睐和认可，缺陷是检测成本较高，可能会出现因对部分细菌缺码而导致的鉴定结果错误。2、免疫学技术作为海洋鱼虾贝类细菌性疾病常用检测诊断方法之一的免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应捕捉致病菌，涉及ELISA技术、免疫荧光法和蛋白质印迹法(Westernblot)，准确性高，检测速度快，缺点是成本稍高，对实验技能要求高。3、核酸检测技术随着分子生物学发展和基因工程技术的兴起，以核酸为基础的检测技术被成功用于弧菌的快速检测，包括PCR、核酸探针和16SrRNA技术，灵敏度高，特异性强，难点在于特异性引物的设计能否对亲缘关系相近，分化程度不够的物种进行区分。多重聚合酶链式反应(multiplexpolymerasechainreaction，M-PCR)是利用精心设计的多对引物在同一个PCR体系中同时扩增多个目的基因，以弥补单一引物扩增易漏检的不足，降低实验材料损耗，缩短检测时间，自ChamberlianJS于1988年首次提出这一概念以来，M-PCR技术已逐步被用于细菌病的诊断和病原体的鉴定等，应用前景相当广阔。实际应用过程中，靶标序列的选择、引物设计以及实验条件的控制皆为该项技术的难点。此外，微量外源性DNA的污染导致的假阳性结果和增菌培养基选择不当造成的假阴性结果也是其容易产生的问题。鉴于M-PCR技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。二重和三重PCR检测屡有相关报道，但由于多重PCR影响因素复杂，不同的引物、模板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及其比例等会产生复杂的综合效应，因此同时检测的目标微生物种类越多，PCR体系建立的难度越大。经国内外文献查询，尚未见有多重PCR应用于霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌快速检测的相关报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组、检测方法和试剂盒，可实现对霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的快速检测。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供了设计和筛选特异性引物的技术方案及一种多重PCR检测致病弧菌的引物组：1、构建阳性内对照(IAC)扩增引物和模板以弧菌的16SrDNA序列为模板设计一对引物，扩增其中的663bp大小的片段，作为检测的IAC。IAC上游引物序列为5’-CGGTGAAATGCGTAGAGAT-3’，IAC下游引物的序列为5’-TTACTAGCGATTCCGAGTTC-3’。2、筛选不同弧菌的特异靶基因用于引物设计在以PCR为基础的弧菌鉴定方法中，靶基因的选择是首要的难点和要点，这类靶基因主要包括毒力基因和看家基因，既要保证该靶基因在属内相对保守，使其具有通用性，又要求其在种间的同源性较低以实现特异性。通过文献分析和检测需求分析，获得了每一种致病弧菌候选扩增的基因或者DNA片段：在不同生物型或血清型霍乱弧菌菌株之间高度保守的外膜蛋白基因OmpW本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其特征在于，其包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对；所述检测霍乱弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述检测溶藻弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；所述检测河流弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述检测鳗弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其特征在于，其包含检测霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌的引物对；所述检测霍乱弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示；所述检测溶藻弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示；所述检测河流弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示；所述检测鳗弧菌的引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示。2.根据权利要求1所述的同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组，其特征在于，还包含阳性内对照引物对，所述阳性内对照引物对的上下游引物的核苷酸序列分别由SEQIDNO.9、SEQIDNO.10所示。3.一种使用引物组对霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌和鳗弧菌进行多重PCR检测的方法，其特征在于，将霍乱弧菌的检测引物对、溶藻弧菌的检测引物对、河流弧菌的检测引物对和鳗弧菌的检测引物对与待测样品的DNA进行多重PCR反应，反应结束后对PCR反应产物进行电泳分析以确定样品中是否含有霍乱弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌或鳗弧菌；其中所述霍乱弧菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鲤群，黄蓝青，林峻，蔡伟文，赵依依，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35