包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链及其缀合物制造技术

本公开涉及重组免疫球蛋白重链，其包含VH‑结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环a)由位于中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2‑结构域的N‑末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)在(b)的序列的N‑末端包含至少两个氨基酸，d)在(b)的序列的C‑末端包含至少6个氨基酸，且e) 其中在(b)的序列的C‑和N‑末端的氨基酸不是半胱氨酸，以及涉及其在基于酶分选酶的定点缀合中的用途。

Recombinant immunoglobulin heavy chain containing its sorting loop and its conjugates

The present disclosure involves the recombinant immunoglobulin heavy chain, which includes the VH domain, the CH1 domain, the hinges of the most C terminal cysteine, the sorting enzyme conjugation ring, the CH2 domain, and the CH3 domain, in which the sorting enzyme conjugates ring a) is the most C terminal cysteine and immunization at the intermediate hinge region. The VFX1FPP (SEQ ID NO:2; X1 is L or I) at at least 16 amino acids between the VFX1FPP (SEQ ID NO:2; X1 is L or I). The terminal end of N contains at least two amino acids, d) at the C terminal end of the (b) sequence containing at least 6 amino acids, and E) in which the amino acid of the sequence of (b) and the amino acid at the terminal of N is not cysteine, and involves its use in the fixed-point binding of the enzyme based enzyme separation enzyme.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链及其缀合物本专利技术涉及包含分选酶缀合环的重组免疫球蛋白重链，通过使用酶分选酶缀合和/或标记此类重组免疫球蛋白重链的方法，以及经由所述方法获得的缀合物/标记的产物。专利技术背景蛋白的位点特异性修饰是有挑战性的问题，特别是对于用于诊断或治疗应用的抗体。在工业规模上经济且适用的位点特异性多肽修饰的可靠方法是非常重要的。蛋白官能化的早期方法通过使蛋白与过量的硫醇或胺反应性试剂诸如马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺酯分别反应来利用半胱氨酸或赖氨酸残基的反应性。它们丰富，分布广泛，并且由于适当偶联化学的可用性而容易修饰。然而，“赖氨酸-标记”策略，当例如用于标记抗体或其抗原结合片段时具有几个缺点：a)其经常导致抗原结合活性(在抗原结合位点中或其附近的赖氨酸)的显著降低；b)单标记的缀合物，甚至在相同的1：1化学计量下，也由包含经由多肽内的赖氨酸中的不同赖氨酸附接的标记物的混合物组成，以及c)期望的1:1产物的产率相当低。近期最重要的位点特异性蛋白标记方法之一是经由酶促反应将生物正交官能团并入蛋白。对于关于“蛋白的酶促标记”的最近综述，参见M.Rashidian等人,BioconjugateChemistry24(2013)1277-1294。该综述中涵盖的用于位点特异性缀合的酶包括甲酰甘氨酸生成酶、唾液酸转移酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、O-GlcNAc翻译后修饰、分选(sortagging)、谷氨酰胺转移酶、法尼基转移酶、生物素连接酶、硫辛酸连接酶和N-肉豆蔻酰基转移酶。分选酶A(SrtA)是将蛋白共价附接至细菌细胞壁的膜结合酶。SrtA底物上的具体分选酶识别基序是LPX1TX2(SEQIDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基，且X2是G或A)。分选酶在残基苏氨酸(T)和X2(G或A)之间切割。分选酶亲核体(也称为分选酶底物)上的连接基序，即变得附接至细菌细胞壁上的底物的肽聚糖的多肽部分，天然地是五甘氨酸基序。已经显示，在肽聚糖的N-末端的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.,等人,PeptideScience94(2010)385-396)。该反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，所述硫酯酰基-酶中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解，由此将肽聚糖共价连接至蛋白底物并再生SrtA。在现代生物化学实验室中，SrtA可以例如用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白。在WO2010/087994中，报道了SrtA介导的连接的方法及其用途。Marvin,J.S.,等人(ActaPharmacol.Sinica26(2005)649-658)报道了针对IgG-样双特异性抗体的重组方法。Levary,D.A.,等人(PLoSone,6(2011)e18342.1-e18342.6)显示由分选酶A催化的蛋白-蛋白融合。在WO2013/003555中，报道了使用分选酶来安装用于蛋白连接的点击化学把手。抗表皮生长因子受体抗体至单链形式的工程改造和通过分选酶A介导的蛋白连接的标记由Madej,M.P.,等人(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)报道。Ta,H.T.,等人报道了酶促单链抗体标记作为心血管疾病中靶向分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.,等人报道了制备和破坏肽键-使用分选酶的蛋白工程改造(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。缺乏N-末端膜-锚定基序(例如，金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)的截短的SrtA已被用于蛋白标记、共价蛋白固定以及将新型官能团并入蛋白中(Ton-That,H.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(1999)12424-12429;Ilangovan,H.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(2001)6056-6061)。高度期望位点特异性标记的多肽的最重要类别之一是免疫球蛋白或抗体。尽管完整抗体(通常是IgG、IgA或IgM)对于大多数应用是理想的，但通过使用抗体片段(诸如Fab、Fab’和F(ab')2)来增强某些程序的性能。主要目标抗体片段是抗原结合片段。几种类型的抗原结合片段是可能的，但各自至少含有抗原结合所需的免疫球蛋白重链和轻链(分别为VH和VL)两者的可变区的那些部分，其(通常通过二硫键)保持在一起以保存抗体结合位点。通常使用例如消化或切割免疫球蛋白结构的某些部分的蛋白酶，以及，如果必要，使用分裂在F(ab')2片段的铰链区中的二硫键的还原剂，来完成抗体片段化。酶促片段化有点费力，需要蛋白的酶介导的消化的优化，需要充足的抗体供应(例如10mg或更多)以使其合理有效并且此外通常需要复杂的纯化步骤。抗体的及时和昂贵的片段化通常仅当目标抗体大量可用并且特定应用需要其时才进行。抗体片段可以例如使用现有技术程序进行化学标记，其具有例如关于上面提及的产率和再现性的所有缺点。定点缀合，例如通过酶促进的定点缀合，最近已受到高度关注。分选酶标记-至少理论上-可以用于生成抗体片段并同时“标记”那些片段。在理论上，抗体应当允许并入分选酶标签，例如，在基因工程改造的重组抗体的Fc-区中，并使用该分选酶标签用于同时切割和缀合。在理论上且取决于分选酶标签的位置，因此应当可能例如分别获得F(ab)或F(ab’)2片段的缀合物。然而，当用另外天然抗体尝试分选酶标记(即仅插入识别序列LPETG)(如在由杂交瘤产生的小鼠单克隆抗体中)时，该方法完全不起作用或产率低/令人失望。然而，存在极大的需求，以经济上和工业上适用规模经由同时切割和位点特异性多肽缀合来实现最相关抗体片段如F(ab)或F(ab’)2分别的分选酶介导的“标记”。令人惊讶地，现在已发现，分选酶可用于在具有如下文所公开的特性的重组抗体重链的分选酶介导的切割后缀合抗体-片段(例如在抗体-片段标记中)。专利技术概述已经发现，如果在免疫球蛋白重链的中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和CH2-结构域之间重组引入特殊的分选酶缀合环，则分选酶介导的重组抗体的切割和连接是可能的。在一个实施方案中，本专利技术公开了重组免疫球蛋白重链，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C-末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环：a)由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP(SEQIDNO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2(SEQIDNO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。进一步公开了包含至少两条如下文所公开的重组免疫球蛋白重链的抗体。在一个实施方案中，这些抗体是IgG类的并且具有两条如下文所公开的重组免疫球蛋白重链。如文报道的一个方面是用于产生重组免疫球蛋白重链的分选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组免疫球蛋白重链，其包含VH‑结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环a) 由位于中间铰链区的最C‑末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2‑结构域的N‑末端处的VFX1FPP (SEQ ID NO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b) 包含由氨基酸序列LPX1TX2 (SEQ ID NO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c) 在(b)的序列的N‑末端包含至少两个氨基酸，d) 在(b)的序列的C‑末端包含至少6个氨基酸，且e) 其中在(b)的序列的C‑和N‑末端的氨基酸不是半胱氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.25 EP 15186821.31.重组免疫球蛋白重链，其包含VH-结构域、CH1结构域、向下至中间铰链区的最C-末端半胱氨酸的铰链区、分选酶缀合环、CH2结构域和CH3结构域，其中所述分选酶缀合环a)由位于中间铰链区的最C-末端半胱氨酸和免疫球蛋白重链CH2-结构域的N-末端处的VFX1FPP(SEQIDNO:2；其中X1是L或I)共有序列之间的至少16个氨基酸组成，b)包含由氨基酸序列LPX1TX2(SEQIDNO:01)组成的分选酶识别基序，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A，c)在(b)的序列的N-末端包含至少两个氨基酸，d)在(b)的序列的C-末端包含至少6个氨基酸，且e)其中在(b)的序列的C-和N-末端的氨基酸不是半胱氨酸。2.权利要求1的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2(SEQIDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的C-末端包含至少9个氨基酸。3.权利要求1或2的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2(SEQIDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸。4.权利要求1或2的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2(SEQIDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少8个氨基酸。5.根据权利要求1至3中任一项所述的重组免疫球蛋白重链，其中所述分选酶缀合环在序列LPX1TX2(SEQIDNO:01，其中X1可以是任何氨基酸残基且X2是G或A)的N-末端包含至少5个氨基酸，且在所述序列的C-末端包含至少9个氨基酸。6.根据权利要求1至3中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：A恩格尔，P库巴莱克，A尼希特尔，T厄尔施莱格尔，R施莱希特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH