本发明专利技术公开了一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞，重组溶葡萄球菌素基因由牛生长激素信号肽加上突变的溶葡萄球菌素成熟肽组成，在他的5′端和3′端加入酪蛋白基因的调控序列，在酪蛋白5′端和EGFP的终止密码子后各添加一个鸡β乳球蛋白的绝缘子元件。用整合了目的基因的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆胚胎。通过胚胎移植技术将发育正常的转基因克隆胚胎，有望生产出转重组溶葡萄球菌素基因的抗乳房炎的高产奶牛。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因克隆动物
，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种重组溶葡萄球菌素位点特异性整合载体及其构建的重组细胞。
技术介绍
奶牛乳房炎(mastitis)又名奶牛乳腺炎，主要由环境中的病原微生物感染引起的，是给奶牛养殖者带来严重经济损失的主要疾病之一，严重影响奶牛养殖业的健康发展。有资料报道美国每年因为奶牛乳房炎造成的奶产品产量和质量下降等损失达到350万美元。奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和亚临床型乳房 炎。引起奶牛乳房炎可能有多种因素，包括牛本身的状况、治病的微生物和影响奶牛和微生物环境因素。其中治病的微生物种类很多，金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的病原菌，该菌可引起急性、慢性和亚临床性(隐性乳房炎)乳房炎，给奶业生产带来巨大损失，不仅产量下降，还增加治疗和给奶牛医疗月艮务的费用(Gill, J. et al, 2006. Efficacy and pharmacokinetics of bacteriophagetherapy in treatment of subclinical Staphylococcus aure—us mastitis inlactating dairy cattle. Antimicrob. Agents Chemother. 50，2912-2918)。多年来，治疗奶牛乳房炎都是采用广谱抗生素治疗的方法，尽管有效，但是治愈率不足50%。广谱抗生素的应用也导致了严重的耐药菌株的产生，增加了治疗的难度(D. Ferber. Antibiotic resistance-Livestock feed ban preserves drugs' power. [J].Science 2002;295:27-28)。因此，使用病原菌特异的抗生素有望减少抗性产生的机率。为了减少广谱抗生素的使用，避免对抗生素有抗性的菌株的出现，我们通过转基因奶牛的乳腺分泌病原菌特异的抗菌素，从而避免大量使用抗生素所引起的问题，抵抗奶牛乳房炎(D. E. Kerr and 0. Wellnitz Mammary expression of new genes to combatmastitis [J] Anim Sci 2003.81:38-47)。转基因动物的生产从20世纪70年代中叶开始，用原核显微注射生产转基因动物持续了 20 多年(BOWEN RA, REED ML, SCHNIEKE A, et al. Transgenic cattle resultingfrom biopsied embryos !expression of c_ski in a transgenic calf[J]. Biol Reprod,1994,50 :664-8),但这种技术的广泛应用有一定的局限性，外源基因往往是随机整合。在家畜上，胚胎干细胞还没有建系(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A, CHEN LR, et al. Isolationof pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells [J]. BiolReprod, 1997, 57 :1089)。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(G00 J, BHUIYAN M. M. U. , HYUN Y J, et al. An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alphaI-antitrypsin gene [J]. Theriogenology, 2006,65 (9) :1800-1812.)，其突出的优点是直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，这样只需在体细胞核移植前选择状态最佳的供体细胞，不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本。溶葡萄球菌素(Lysostaphin)是模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)分泌的ー种金属蛋白酶，具有水解葡萄球菌细胞壁肽聚糖五肽桥联的催化活性，对金葡菌有强大的溶菌作用(Recsei P A,GrussA D,Novick R P. Cloning, sequence, and expression ofthe lysostaphin gene from S taphylococcus simulans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(5) :1127-1131) 天然溶葡萄球菌素基因编码ー种蛋白前体，产生的菌先表达蛋白前体，分泌到胞外后经巯基蛋白酶作用切去N端多个13aa重复序列而成为成熟的溶葡萄球菌素，成熟溶葡萄球菌素比蛋白前体的活性约高4. 5倍(Thumm G,Gotz F. Studies onP rolysostaphin p rocessing and characterization οι the Lysostapmn immunityfactor (Lif)of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus[J]. MolMicrobiol,1997,23(6) :125ト1265)。国外有关成功转lysostaphin基因的动物研究有通过转基因小鼠乳腺表达Lysostaphin抗葡萄球菌感 染，结果表明通过遗传工程的方法增强泌乳动物健康降低乳房炎的经济负担是ー种有效的策略(David E. Kerri, Karen Plaut, A. JohnBramley, etal Lysostaphin expression in mammary glanas comers protectionagainst staphylococcal infection in transgenic mice[J]. Nat Biotechnol 2001 ；19:66-70)。2005年携带Lysostaphin基因的转基因牛出生，提高奶牛抗葡萄球菌感染的乳房炎的能力(Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, etal. Genetically enhanced cowsresist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 2005 ；23 445-451.)。国内对lysostaphin的研究只见于作为抗生素治疗外伤感染，奶牛乳房炎和子宫内膜炎的治疗，取得了很好的效果。但是，以lysostaphin作为目的基因，以动物细胞为宿主细胞，特别是奶牛的体细胞为宿主细胞的表达载体，还少报道；也没有以lysostaphin作为目的基因构建基因克隆胚的核供体细胞细胞系的报道。OC31特异性整合酶可以介导基因的单向插入，发生位点特异性重组后产生的位点由于细胞内没有其他辅助因子存在，重组后的位点不再是整合酶的识别底物，与Cre和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。2.如权利要求I所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在其5'端连接如SEQ.ID. NO. 2所示的CSN5调控元件，在其3'端连接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3调控元件。3.如权利要求2所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在CSN5调控元件的5'端还连接有如SEQ. ID. NO. 4所示的att B序列,在att B序列的上下游还分别设有绝缘子序列。4.如权利要求3所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的绝缘子序列为如SEQ. ID. NO. 5所示的鸡β -乳球蛋白绝缘子序列。5.如权利要求I 4任何一项所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在重组溶葡萄球菌素基因的在上游还连接有荧光标记基因，下游还连接有抗生素筛选基因。6.如权利要求5所述的重组溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的荧光标记基因与重组溶葡萄球菌素基因之间设有終止子或绝缘子序列，在抗生素筛选基因的上下游连...
【专利技术属性】
技术研发人员：权富生，张涌，黄欣，张勃伟，上官陶，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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