螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体主要由如下方法制备而成：螨变应原提取、对鸡进行强化免疫、粗提物制备、精提、纯化。本发明专利技术的抗螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白及其制剂的抗体活性高、对螨引起的局部致敏有特异性的防御作用，对其它致敏原引起的局部致敏有良好的隔阻效应，无免疫原性，对人体皮肤黏膜无不良反应，安全性能高。

Mite allergen specific yolk immunoglobulin antibody and its antiallergic agent

The present invention relates to an allergen specific yolk immunoglobulin antibody and its anti allergy preparation. The specific yolk immunoglobulin antibody of mites allergens mainly consists of the following methods: Acara allergen extraction, chicken immunization, preparation of crude extract, extract and purity. The anti mites allergen specific yolk immunoglobulin and its preparation have high antibody activity and specific defense effect on local sensitization caused by mites. It has good septum effect on local sensitization caused by other allergens, no immunogenicity, no adverse reaction to human skin mucous membrane and high safety performance.

【技术实现步骤摘要】
螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，尤其涉及一种螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂。
技术介绍
变应性鼻炎(allergicrhinitis，AR)是机体暴露于变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。国内外大量的流行病学调查显示，全球的AR患者超过5亿。AR已成为主要的呼吸道慢性炎性疾病，给患者生活质量和社会经济带来严重影响。面对如此高的患病率以及患者对生活质量改善的要求，临床上各种诊疗措施应运而生，鼻腔局部糖皮质激素、口服抗组胺药和白三烯受体阻滞剂是目前最主要的治疗方法，但只能控制症状。脱敏治疗可使70%左右的患者产生对相应过敏原的耐受，但脱敏周期长达3年以上，费用很高，而且要在医生观察下进行治疗，病人的依从性不高。螨在亚热带和热带地区最主要的螨为屋尘螨、粉尘螨等。屋尘螨以人类皮屑为食，并主要生活在床垫、床底、枕头、地毯、家具及绒毛玩具中。在热（20℃以上）且潮湿（相对湿度大于80%）的环境中繁殖最快。屋尘螨变应原包含在其排泄物颗粒中，当沾染的织物被碰动后，这些颗粒便暴露于空气中并能够很快再次沉积下来，螨作为室内的主要致敏原，螨抗原对气道上皮细胞和先天性免疫细胞有直接刺激，易引起过敏性鼻结膜炎和过敏性哮喘，并有助于特应性湿疹和其他过敏性皮肤病的产生。如果在局部施用针对具有酶活性变应原的抗体，其活性就会被削弱，就不能与IgE结合，过敏反应就不会发生。卵黄免疫球蛋白IgY是抗体的一种，是采用生物高科技从禽类卵黄中提取的免疫球蛋白，在结合效价及中和病毒、细菌、真菌及昆虫等抗原的能力方面，IgY与人类抗体相似，IgY会与相应病源微生物表面的抗原决定族特异性结合而抑制过敏反应的发生，这些病源微生物抗原被IgY结合后活性降低，而失去致病能力，被IgY结合的抗原很容易被人类免疫系统识别，并通过单核细胞等降解，因为IgY不会改变病源微生物的遗传物质和生物学特性，所以不会产生耐药性，IgY的这一特征使其在局部应用具有重要意义。而且，皮肤过敏患者亦可应用，受益人群非常广泛。因此，针对螨虫过敏原，亟需开发新的包括卵黄免疫球蛋白IgY的抗体。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提出了一种螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，用于治疗由螨变应原引起的过敏性鼻炎、过敏性鼻炎伴哮喘和过敏性皮炎等疾病。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案为：本专利技术提出了一种螨变应原特异性IgY抗体的制备方法，包括以下步骤：螨变应原制备：选取纯化螨虫体，采用Coca’s液提取方法，制得螨变应原粗提物；免疫疫苗制备：将所述螨变应原粗提物溶解在0.1mol/L的PBS溶液中充分混匀，得到螨变应原溶液,其蛋白浓度为2mg/ml；吸取1-1.5ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅰ，按1:1的比例将弗氏完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅰ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅰ，作为首免疫苗；吸取2-3ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅱ，按1:1的比例将弗氏不完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅱ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅱ，作为强化免疫疫苗；对鸡进行强化免疫：吸取所述首免疫苗剂量200μl，分别在鸡的左右翅下各两处进行皮下注入进行首次免疫，然后每隔10天使用所述强化免疫疫苗强化免疫一次，共强化免疫四次；在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml，首次免疫和第一次强化免疫在产蛋前期进行；IgY抗体的提取：对收集的鸡蛋进行取蛋黄处理，1体积蛋黄加5-6体积的双蒸水，充分搅拌混合均匀后，调试pH至5-6，然后将其置于4℃静置8-10小时，冷冻离心15-30min，取上清液，获得粗提物；精提：在获得的粗提物中加入60%硫酸钠沉淀一次，再用14%硫酸钠溶液沉淀两次，取上清液进行超滤除菌、除离子获得精提物；纯化：通过纤维素对获得的精提物进行柱层析纯化，得到螨变应原特异性IgY抗体。进一步的，所述螨变应原粗提物包括：屋尘螨蛋白Derp1和Derp2、粉尘螨蛋白Derf1和Derf2。进一步的，所述纯化螨虫体通过如下方法获取：将螨虫接种至面粉培养基，将所述面粉培养基置入温度为25℃、相对湿度75%的恒温箱中培养4-6周，形成螨虫群落，将所述螨虫群落连同部分面粉培养基移入装有新鲜饲料的容器中继续培养4-6周，重复上述操作获得大量纯螨，将获得的大量纯螨移入整体螨培养基进一步繁殖，获得纯化螨虫体。进一步的，所述进行强化免疫的鸡为梅林鸡、海兰褐鸡和京红鸡中的一种。进一步的，所述进行强化免疫的鸡的鸡龄为120-150天，每只鸡为1.2-1.5kg。进一步的，在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并对经过强化免疫的鸡每6只抽取1只，在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml。进一步的，所述冷冻离心的速度为12000r/min。进一步的，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性鼻炎和过敏性鼻炎伴哮喘的药物中的用途。进一步的，所述螨变应原特异性IgY抗体在制备治疗由螨变应原引起的过敏性皮炎的药物中的用途，所述过敏性皮炎包括痤疮。同时，提出了一种根据前面所述的螨变应原特异性IgY抗体制成的抗过敏制剂，按照重量百分含量计包括如下组分：螨变应原特异性IgY抗体或其粗提物0.15-2%；羟乙基纤维素0.5-1%；木糖醇0.5-1.0%；丙三醇1.0-2.0%；聚山梨酯800.3-0.5%；清凉醇0.1-0.3%；氯已定0.01-0.02%；双蒸水加至100%。本专利技术的有益效果至少包括：本专利技术螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白抗体及其抗过敏制剂，可达到引起过敏性鼻炎和过敏性哮喘主要致敏源的全覆盖，制得的抗体活性高、对螨引起的局部致敏有特异性的防御作用，对其它致敏原引起的局部致敏有良好的隔阻效应，无免疫原性，对人体皮肤黏膜无不良反应，安全性能高。附图说明图1为本专利技术螨变应原粗提物电泳图。图2为本专利技术螨变应原特异性卵黄免疫球蛋白IgY抗体电泳图。图3为本专利技术螨变应原粗提物WesternBlot检测图。图4为本专利技术抗过敏制剂成膜试验检测图。图5为本专利技术抗过敏制剂动物表面皮肤和角膜过敏及毒性试验检测图。图6为本专利技术抗过敏制剂的1号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图7为本专利技术抗过敏制剂的2号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图8为本专利技术抗过敏制剂的3号样品药物细胞毒性试验抑制拟合曲线图。图9为本专利技术抗过敏制剂细菌阻隔试验图。其中：图1中，M为标准蛋白分子量，1为2、3和4三种变应原混合，2为本专利技术制备的螨变应原粗提物，3为阿罗格标准屋尘螨皮试抗原，包含Derp1和Derp2蛋白，4为阿罗格标准粉尘螨皮试抗原，包含Derf1和Derf2蛋白；图2中，M为标准蛋白分子量，A、B、C和D分别为：本专利技术重复试验获得的IgY抗体、本专利技术首次试验获得的IgY抗体、抗多种细菌抗体和空白对照；a、b、c和d分别为A、B、C和D对应抗体50℃水浴处理30分钟；图3中，1为2、3和4三种变应原混合，2为本专利技术制备的螨变应原粗提物，3为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种螨变应原特异性IgY抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：螨变应原制备：选取纯化螨虫体，采用Coca’s液提取方法，制得螨变应原粗提物；免疫疫苗制备：将所述螨变应原粗提物溶解在0.1mol/L 的PBS 溶液中充分混匀，得到螨变应原溶液, 其蛋白浓度为2mg/ml；吸取1‑1.5ml螨变应原溶液，加入5.25‑6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅰ，按1:1 的比例将弗氏完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅰ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅰ，作为首免疫苗；吸取2‑3ml螨变应原溶液，加入5.25‑6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅱ，按1:1 的比例将弗氏不完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅱ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅱ，作为强化免疫疫苗；对鸡进行强化免疫：吸取所述首免疫苗剂量200μl，分别在鸡的左右翅下各两处进行皮下注入进行首次免疫，然后每隔10天使用所述强化免疫疫苗强化免疫一次，共强化免疫四次；在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并在鸡翅下采血，采血量为1‑1.5ml，首次免疫和第一次强化免疫在产蛋前期进行；IgY抗体的提取：对收集的鸡蛋进行取蛋黄处理，1体积蛋黄加5‑6体积的双蒸水，充分搅拌混合均匀后，调试pH至5‑6，然后将其置于4℃静置8‑10小时，冷冻离心15‑30min，取上清液，获得粗提物；精提：在获得的粗提物中加入60%硫酸钠沉淀一次，再用14%硫酸钠溶液沉淀两次，取上清液进行超滤除菌、除离子获得精提物；纯化：通过纤维素对获得的精提物进行柱层析纯化，得到螨变应原特异性IgY抗体。...

【技术特征摘要】
1.一种螨变应原特异性IgY抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：螨变应原制备：选取纯化螨虫体，采用Coca’s液提取方法，制得螨变应原粗提物；免疫疫苗制备：将所述螨变应原粗提物溶解在0.1mol/L的PBS溶液中充分混匀，得到螨变应原溶液,其蛋白浓度为2mg/ml；吸取1-1.5ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅰ，按1:1的比例将弗氏完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅰ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅰ，作为首免疫苗；吸取2-3ml螨变应原溶液，加入5.25-6ml生理盐水混匀，得到螨混合抗原溶液Ⅱ，按1:1的比例将弗氏不完全佐剂加入螨混合抗原溶液Ⅱ中混合均匀，制得乳状螨复合抗原免疫佐剂Ⅱ，作为强化免疫疫苗；对鸡进行强化免疫：吸取所述首免疫苗剂量200μl，分别在鸡的左右翅下各两处进行皮下注入进行首次免疫，然后每隔10天使用所述强化免疫疫苗强化免疫一次，共强化免疫四次；在第三次和第四次强化免疫后分别收集经过强化免疫的鸡所产的鸡蛋，并在鸡翅下采血，采血量为1-1.5ml，首次免疫和第一次强化免疫在产蛋前期进行；IgY抗体的提取：对收集的鸡蛋进行取蛋黄处理，1体积蛋黄加5-6体积的双蒸水，充分搅拌混合均匀后，调试pH至5-6，然后将其置于4℃静置8-10小时，冷冻离心15-30min，取上清液，获得粗提物；精提：在获得的粗提物中加入60%硫酸钠沉淀一次，再用14%硫酸钠溶液沉淀两次，取上清液进行超滤除菌、除离子获得精提物；纯化：通过纤维素对获得的精提物进行柱层析纯化，得到螨变应原特异性IgY抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述螨变应原粗提物包括：屋尘螨蛋白Derp1和Derp2、粉尘螨蛋白Derf1和...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢民强，
申请(专利权)人：广州益琪琳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44