本发明专利技术公开了一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用。本发明专利技术以IgG抗体的CH2片段为对象，在已有的改造骨架m01s的基础上，预测易聚集区，进行进一步优化，得到新骨架m01sm1。m01sm1相对于突变体m01s，其稳定性更好，有利于开发更稳定的C‑型单域抗体，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。
CH2 domain mutant of anti aggregating human IgG antibody and its application
The invention discloses a CH2 domain mutant with anti aggregating human IgG antibody and its application. The present invention is based on the CH2 fragment of IgG antibody, and on the basis of the existing modified skeleton m01s, the easy aggregation area is predicted, and the new skeleton m01sm1 is obtained. Compared with the mutant m01s, m01sm1 has a better stability and is beneficial to the development of a more stable C type single domain antibody. It can reduce the production, purification and preservation cost of the monoclonal antibody or Fc fusion protein, and its anti aggregation ability is better, which can reduce the risk of clinical use because of the aggregation of protein.
【技术实现步骤摘要】
抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用
本专利技术涉及生物
，具体地指一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用。
技术介绍
抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Westernblot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。同时，基于CH2片段开发的小型化抗体以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，可以识别全长抗体难以识别的表位。然而，以野生型CH2片段为骨架开发的抗体存在自身局限性，如如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。针对CH2的稳定性较弱的缺陷，有研究者通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(GongR,etal.,JBiolChem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(GongR,etal.,MolPharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(GongR,etal.,JBiolChem.,2011)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(GehlsenK,etal.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提高IgG或者以CH2为骨架的小型化抗体抗聚集性，提供一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用，在已有的改造骨架m01s的基础上，对其进行进一步优化，，在保证其空间构象的同时，提高其抗聚集性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体，命名为m01sm1，其氨基酸序列为SeqIDNo.1。可选地，所述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体的编码基因序列为SeqIDNo.2。本专利技术还揭示了上述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体在制备Fc融合蛋白中的应用以及在制备单克隆抗体中的应用。本专利技术以IgG抗体的CH2片段为对象，在已有的改造骨架m01s的基础上，预测易聚集区，进行进一步优化，得到新骨架m01sm1。将该CH2骨架表达纯化之后，对其存在形式与分子结果进行了分子筛、圆二色谱分析，通过紫外分光光度计与荧光光谱仪测定其稳定性、抗聚集能力；随后，利用可识别CH2结构域的单抗Anti-CH2对其构象变化进行了分析，表明定向修饰改造后的CH2骨架空间构象变化后提高了其稳定性。新的CH2骨架在单克隆抗体、Fc融合蛋白或者直接以该骨架开发抗体的研发和临床使用上具有重要意义，包括提高其稳定性后有利于降低生产、纯化成本，有利于降低单抗聚集引发的免疫原性等。本专利技术的有益效果：1)相对于突变体m01s，其稳定性更好，有利于开发更稳定的C-型单域抗体，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本。2)相对于突变体m01s，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。附图说明图1为m01sm1存在形式分析图。图2为圆二色谱分析m01sm1分子构象的分析图。图3为m01sm1与CH2蛋白在的抗聚集性比较图。图4为m01sm1与anti-CH2单抗的亲和力证明图表。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。实施例1:m01sm1的氨基酸序列和核苷酸序列本专利技术提供的m01sm1骨架，是通过以下方法得到：首先，构建m01s的易聚集区氨基酸随机突变噬菌体展示文库。随后利用特异性抗CH2抗体对该噬菌体展示文库进行筛选，获得候选克隆。随后送测序，经过鉴定得到m01sm1。m01sm1的氨基酸序列为SeqIDNo.1，编码基因序列为SeqIDNo.2。实施例2：m01sm1分子构象与存在形式(单体、二聚体等)AKTA分析m01sm1存在形式：将纯化后的m01sm1蛋白浓缩到1mg/ml，PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液，过ColumnSuperdex75Increase10/300GL，其中，流速为1ml/min，进而对其存在形式进行检测，结果如图1，对照标准曲线可以发现，蛋白分子量约为14kDa，结果表明它们以单聚体形式存在。CD检测蛋白分子构象：将m01sm1蛋白稀释到0.3mg/ml，PBS(pH7.4)为对照，在近紫外端(波长λ＝190nm～260nm)不同波长条件下检测其平均摩尔椭圆度，如图2，在λ＝218nm处有一个明显波谷，表明上述蛋白二级结构为β-折叠。实施例3：m01s与m01sm1抗聚集性比较浊度实验：将m01s与m01sm1蛋白终浓度调整为1mg/ml，在50℃水浴锅处理，每隔一定时间取样，在λ＝320nm处检测吸光度并记录数据，其中，PBS溶液为空白对照，比较与m01s蛋白的抗聚集性强弱,从图3A中可以发现m01sm1信号上升趋势较缓，表明其抗聚集能力更好。ThT荧光实验：将m01s与m01sm1蛋白终浓度调整为1mg/ml，加入ThT，以440nm为激发光，482为吸收光，测定250min内荧光变化。通过测定m01sm1和m01s蛋白在不同时间与ThT结合发光强度，比较m01sm1和m01s蛋白的抗聚集性，从图3B中可以发现，与m01s相比，m01sm1的荧光信号上升更为缓慢，m01sm1相比m01s其抗聚集性增强。实施例4：ELISA测定m01sm1与anti-CH2的结合力1.包被anti-CH2抗体，4℃过夜。2.配3％牛奶。3.包被的平板将包被蛋白甩干，用PBS洗一遍，加入100μl3％牛奶封闭1h。4.甩掉封闭液，拍干。5.m01sm1以1μmol为起点，三倍倍比稀释，稀释6个稀释度，作为一抗。6.加入一抗，每孔加入50μl，37度温育1h。7.甩干一抗，PBST手洗一遍，每孔100μl；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。8.二抗为HRP-anti-His抗体，1:5000稀释，15ml，牛奶浓度为1％，37度温育1h。9.甩干二抗，PBST手洗一遍，每孔100μl；机洗8遍；PBS洗一遍；拍干。10.每孔加入50μlHRP显色液。11.显色。通过ELISA分析anti-CH2单抗与m01sm1亲和力，在λ＝405nm处检测不同浓度的m01sm1的吸光度并记录分析数据，从图4中可以看到m01sm1与anti-CH2单抗具有很高的亲和力，证明其构象正确。序列表<110>武汉班科生物技术股份有限公司<120>抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用&l本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体，其氨基酸序列为Seq ID No.1。
【技术特征摘要】
1.一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体，其氨基酸序列为SeqIDNo.1。2.根据权利要求1所述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体，其特征在于：所述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚睿，
申请(专利权)人：武汉班科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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