人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体，通过筛选和基因改造后，所获抗体的特异性好、中和活性强、抗聚集性增，适用于制备针对自身免疫性疾病的治疗性药物。

Human monoclonal antibody against human tumor necrosis factor

【技术实现步骤摘要】
人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体
本专利技术涉及生物
，具体地指一种人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNFα)是一种人体炎症反应相关蛋白，过量的TNFα会导致自身免疫性疾病的发生。研发针对TNFα的抗体将有利于降低体内的TNFα含量，加速其在体内的清除，从而治疗相关自身免疫性疾病。目前已有的针对TNFα的抗体由于在临床使用中易产生抗抗体现象，导致该抗体对部分病人失去治疗效果，因此开发新的针对TNFα的人源单克隆抗体有利于缓解该问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于填补现有技术的空白，提供一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体。为实现上述目的，本专利技术提供了一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体，其轻链序列如SEQNo.1所示，其重链序列如SEQNo.3所示。上述针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体对应的碱基序列，其轻链序列如SEQNo.4所示，其重链序列如SEQNo.5所示。本专利技术的有益效果：通过筛选和基因改造后，所获抗体的特异性好、中和活性强、抗聚集性增强，适用于制备针对自身免疫性疾病的治疗性药物。附图说明图1-1为Tango软件预测FC9抗体氨基酸序列的易聚集区。图1-2为Tango软件预测FC9抗体突变后氨基酸序列的易聚集区。图1-3为FC0和FC9的重链突变区域比较图。图2为SDS-PAGE对FC9抗体的检测图。图3为ELISA分析FC9抗体与人TNFα的结合图。图4为FC9抗体降低人TNFα对L929细胞的杀伤效果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例是在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：FC0抗体序列的获得按照已有的文献(ZhuZ,DimitrovDS,MethodsMolBiol,2009)构建了人源Fab噬菌体展示文库，并基于该文库对人TNFα蛋白进行了四轮的筛选，并通过单克隆phageELISA，将其中的阳性克隆送测序，得到了FC0候选克隆的碱基序列，并经氨基酸翻译软件(https://web.expasy.org/translate/)，得到了其氨基酸序列，轻链氨基酸序列如SEQNo.1所示，其重链氨基酸序列如SEQNo.2所示。实施例2：利用Tango软件对获得的FC0氨基酸序列进行优化利用Tango软件(http://tango.crg.es/)对FC0候选克隆的氨基酸序列进行易聚集区预测，发现其中存在较强的易聚集区域，如图1-1，因此对该区域进行点突变，得到FC9抗体，其轻链氨基酸序列如SEQNo.1所示，其重链氨基酸序列如SEQNo.3所示，对应碱基序列，轻链如SEQNo.4所示，重链如SEQNo.5所示。突变后的氨基酸序列经Tango软件重新预测，发现该易聚集区被明显改善，如图1-2，1-3。实施例3：293F细胞表达FC9抗体并SDS-PAGE检测将突变后的碱基序列克隆到双启动载体pVitro2-neo-mcs(InvivoGen)上，利用PEI转染293F细胞后进行蛋白的表达，经过5-7天的表达，将293F细胞的培养上清经ProteinA(GE)纯化，将纯化后的蛋白经过浓换液后，得到溶于PBS缓冲液的FC9抗体。经SDS-PAGE电泳检测，发现其呈现轻链和重链两条带，如图2所示。实施例4：ELISA分析FC9抗体与人TNFα蛋白的结合包被人TNFα蛋白在ELISA板上，将FC9抗体经梯度稀释后作为一抗，HRP标记的Goat-anti-humanIgG-Fc(Abcam)作为二抗，显色后，通过信号强度变化计算EC50，约在0.4nM，如图3所示。实施例5：FC9抗体降低人TNFα对L929细胞的杀伤。人TNFα对L929细胞有较强的杀伤作用，用抗体中和掉人TNFα因子可以降低其对细胞的杀伤效果。为验证FC9抗体对人TNFα的中和作用，梯度稀释的FC9抗体分别与人TNFα混合后加入到提前一天铺好的L929细胞中，加完后放置于37℃培养箱培养，24h后弃去培养基上清，加入CCK-8试剂显色，根据细胞的存活率就算FC9抗体对人TNFα的中和活性，约为20nM，如图4所示。SEQUENCELISTING<110>武汉班科生物技术股份有限公司<120>人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体<130>2019003<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>213<212>PRT<213>轻链(ArtificialSequence)<400>1GluIleValLeuThrGlnSerProGlyThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgThrSerGlnSerValSerSerSer202530TyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeu354045IleTyrGlyAlaSerSerArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerArgLeuGlu65707580ProGluAspPheAlaValTyrPheCysGlnGlnPheGlyThrSerSer859095IleThrPheGlyGlnGlyThrArgLeuGluIleLysArgThrValAla100105110AlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSer115120125GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGlu130135140AlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSer145150155160GlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeu165170175SerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysLeu180185190TyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLys195200205SerPheAsnAr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体，其特征在于，其轻链序列如SEQ No.1所示，其重链序列如SEQ No.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种针对人肿瘤坏死因子的人源单克隆抗体，其特征在于，其轻链序列如SEQNo.1所示，其重链序列如SEQNo.3所示。

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【专利技术属性】
技术研发人员：龚睿，
申请(专利权)人：武汉班科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42