抗TNF-α单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及抗TNF‑α单克隆抗体的制备方法，包括亲和层析，病毒灭活，深层过滤，阴离子交换层析，阳离子交换层析等步骤。本发明专利技术通过在亲和层析淋洗过程中增加缓冲液电导率，以及在阳离子交换层析淋洗过程中改变缓冲液的pH，提高了产品的纯度，同时得到了较高的总回收率。

【技术实现步骤摘要】
抗TNF-α单克隆抗体的制备方法
本专利技术属于蛋白质纯化领域，具体而言涉及一种抗TNF-α单克隆抗体的制备或纯化方法。
技术介绍
肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactorα，TNF-α)是一种促炎细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，能促进淋巴细胞的浸润，加速T细胞的活化，其在正常的免疫应答中发挥抗感染和抗损伤的作用。然而，长期高水平的TNF-α与多种自身免疫疾病和炎症性疾的发生密切相关，如类风湿性关节炎、牛皮癣、克罗恩氏病、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎。TNF-α单克隆抗体能特异性地结合TNF-α，竞争性地阻断TNF-α与其受体结合，阻止其对免疫反应的调控及其对炎症的诱导作用，具有靶向性强、毒副作用低、高效等特点，因此在临床医疗中发挥重要的作用。目前，已有多种TNF-α单克隆抗体药物被批准用于自身免疫和炎症性疾病的治疗，包括英夫利昔单抗(infliximab)、戈利木单抗(golimumab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)。单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如CHO、BHK细胞等，以确保获得期望的折叠和糖基化，所述基因工程包括将目的基因导入到该细胞系中。哺乳动物细胞培养过程中添加包含氨基酸、盐和生长因子等多种成分的培养基，宿主细胞自身产生的宿主蛋白(HostCellProtein，HCP)和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂；且单克隆抗体药物的分子量大、结构复杂，给制造工艺带来较大的困难。但为了确保抗体药物对人体的安全性，必须去除生产过程累积的污染物，保证抗体药物达到较高的纯度。抗体药物制造的下游工艺较复杂，任何不完善都可能造成极大的损失，因此建立有效的下游纯化工艺来增加单克隆抗体的产率和纯度是非常必要的。目前下游工艺常用的纯化手段包括亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析等，虽然生产中常采用这些层析方法，但是层析的具体条件、参数、填料选择的差异会产生完全不同的结果。亲和层析作为单克隆抗体层析分离的重要手段，通常用来捕获细胞培养液中的产品。由于亲和层析材料可特异性吸附抗体，当抗体载量合适时，细胞培养液经过亲和层析后的产品往往可以达到较高的单体纯度，同时还能保证较高的回收率。如果能在亲和层析步骤中尽可能多的除去HCP和核酸等污染物，将会减轻后续色谱层析和深层过滤的压力，进而降低抗体的生产成本。阳离子交换层析一般用于抗体的精纯，其主要作用是去除聚合物高分子量杂质，同时也能进一步去除HCP和核酸，提高单克隆抗体的纯度。本领域常规的做法是低浓度盐上样后选择适合浓度的盐竞争结合阳离子交换材料，从而将抗体洗脱下来，达到分离目的。对于抗体或抗体药物的分离而言，不仅需要尽可能多的降低HCP、核酸和聚合物高分子量杂质等的含量，还需要对电荷异构体进行分离。然而，常规的阳离子交换层析对于与目的蛋白电荷差异较小的酸碱性类似物的分离效果较差。为了解决上述问题，需要开发新的抗体纯化方法，提高抗体的纯度和质量。
技术实现思路
一方面本专利技术的目的包括提供一种可以提高单克隆抗体制品纯度的抗体纯化工艺。另一方面，本专利技术的目的还在于提供一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)细胞培养液深层过滤；(b)亲和层析；(c)病毒灭活；(d)二次深层过滤；(e)阴离子交换层析；(f)阳离子交换层析；(g)病毒过滤和/或超滤。在一些具体实施方案中，所述(a)-(g)各步骤是依次进行的。在一些实施方案中，亲和层析可以采用蛋白A亲和层析填料。在一些具体实施方案中，亲和层析包括但不限于消毒、平衡、上样、淋洗三次、洗脱等步骤。在一些具体实施方案中，亲和层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液电导率增加。例如，可以先用含150mM氯化钠的50mMTris-乙酸缓冲液进行冲洗，再用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，最后用50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗。在一些具体实施方案中，亲和层析采用低pH缓冲液对抗体进行洗脱，例如采用pH＝3-4的缓冲液进行洗脱，优选用pH＝3.5的洗脱缓冲液进行洗脱。在一些实施方案中，亲和层析采用ProteinA亲和层析填料，其步骤包括：①平衡，采用含150mM氯化钠的50mMTris-乙酸缓冲液进行平衡，pH＝7.4；②上样；③淋洗1，第一淋洗液采用含150mM氯化钠和50mMTris-乙酸缓冲液，pH＝7.4；④淋洗2，第二淋洗液采用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑤淋洗3，第三淋洗液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝5.0；⑥洗脱，洗脱液采用50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，pH＝3.5。在一些实施方案中，将亲和层析的洗脱液进行低pH病毒灭活。在一个具体实施方案中，可以通过柠檬酸或Tris溶液将样品pH值调节为约3.0-4.0，18-26℃条件下静置2-4小时来实现病毒灭活。在一些实施方案中，将经过上述病毒灭活的溶液进行二次深层过滤。在一些具体实施方案中，二次深层过滤前需要将样品的pH值调节为约5.6。在一些实施方案中，阴离子交换层析可以采用常规或商业化的各种填料，例如采用POROS50HQ阴离子填料。在一些具体实施方案中，阴离子交换层析步骤包括但不限于预平衡、平衡、上样、平衡、再生、平衡、保存，其中预平衡液可选自含0.5-2.5M氯化钠的10-100mM乙酸钠-乙酸缓冲液，优选含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液，平衡液可选自10-100mM乙酸钠-乙酸缓冲液，优选50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液。在一些实施方案中，阳离子交换层析可以采用常规填料或商业化的填料，例如采用POROSXS阳离子填料。在一些具体实施方案中，阳离子交换层析步骤包括但不限于预平衡、平衡、上样、淋洗、洗脱等。在一些具体实施方案中，所述淋洗包括1-3次淋洗，例如1次淋洗，2次淋洗，或3次淋洗，优选为3次淋洗。在一些具体实施方案中，阳离子层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液pH的改变，如pH上升或下降。在一些具体实施方案中，层析柱平衡后将产品加载到阳离子交换材料中，所述组合物处于第一pH，用平衡缓冲液(又称第一淋洗缓冲液)进行第一次淋洗(淋洗1)，再用pH高于所述第一pH的具有第二pH值的第二淋洗缓冲液进行第二次淋洗(淋洗2)，再用pH低于所述第二pH的具有第三pH值的第三淋洗缓冲液进行第三次淋洗(淋洗3)，最后用电导率大于所述第一淋洗缓冲液、第二淋洗缓冲液、和第三淋洗缓冲液的电导率的洗脱液冲洗层析柱。在一些实施方案中，所述阳离子交换层析的第二pH比第一pH值至少高约1.5以上。在一些具体实施方案中，所述第二pH比第一pH值高至少约1.5，至少约1.6，至少约1.7，至少约1.8，至少约1.9，至少约2.0，至少约2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：/n(a)亲和层析；/n(b)病毒灭活；/n(c)深层过滤；/n(d)阴离子交换层析；/n(e)阳离子交换层析。/n

【技术特征摘要】
20181107 CN 20181132049121.一种纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)亲和层析；
(b)病毒灭活；
(c)深层过滤；
(d)阴离子交换层析；
(e)阳离子交换层析。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述亲和层析的淋洗步骤包括淋洗缓冲液电导率的增加，例如先用含150mM氯化钠的50mMTris-乙酸缓冲液进行冲洗，再用含1M氯化钠的50mM乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，最后用50mM的乙酸钠-乙酸缓冲液进行淋洗，所述亲和层析还包括采用较低pH的缓冲液对目的蛋白进行洗脱。


3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其中阳离子交换层析步骤包括平衡，上样，淋洗三次，洗脱等。


4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中阳离子交换层析淋洗过程包括缓冲液pH的改变。


5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述阳离子交换层析包括：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢一龙，尚战强，陆建胜，苏贤德，胡伟伟，陈强，陈玄，刘倩倩，
申请(专利权)人：正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司，正大天晴药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32