本发明专利技术提供一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。本发明专利技术进一步提供编码该抗CD3单域抗体的核苷酸序列、包含该核苷酸序列的表达载体及宿主细胞。本发明专利技术提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3εN‑末端部分，这些抗体可以用于比如CD3的测定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如双特异性抗体。
Anti CD3 single domain antibody
The invention provides an anti CD3 single domain antibody, the amino acid sequence of SEQ ID from NO.1 and SEQ ID NO.3. The invention further provides a nucleotide sequence encoding the anti CD3 single domain antibody, an expression vector containing the nucleotide sequence and a host cell. Anti CD3 single domain antibody CD3 against N e end portion provided by the invention, these antibodies can be used for the determination of CD3, CD3 and other functional proteins, such as bispecific antibody.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗CD3单域抗体（sdAb）及其氨基酸、核苷酸编码序列。本专利技术还涉及包含该核苷酸编码序列的表达载体和宿主细胞。
技术介绍
自1975年单克隆抗体技术问世之后，抗原特异性的抗体已改变了生物学和医学的多个方面。除了作为重要性的研究工具，单克隆抗体的可用性为发展人类疾病的诊断和新疗法开辟了道路。然而，单克隆抗体在应用范围上有技术上的限制和缺点，例如基于哺乳动物表达系统较昂贵。在过去的几十年，一系列的新技术和方法用于改善传统抗体的性能，尤其是在肿瘤治疗中。例如，给现有抗体加有毒的化合物，包括放射性同位素被链接到单克隆抗体。然而，甚至直到今天，临床使用单克隆抗体量仍然很少。另一个提高肿瘤杀灭效率的方法是使用双特异性的抗体，将免疫细胞引到肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。而最常用的是使用抗CD3抗体将T细胞引到肿瘤细胞。它是通过同时绑定CD3和肿瘤细胞的表面抗原(TAA)，这种双特异性抗体可以能够触发T细胞介导的肿瘤细胞溶解。CD3（群集分化 3）T细胞受体有助于激活细胞毒性T细胞。它是由四个不同的链组成的一种复杂的蛋白质。在哺乳动物中，包含CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。很多双特异性抗体使用单链抗体。单链抗体是从传统的IgG分子得到的完整的最小的抗原结合片段。不幸的是，细菌表达的scFvs产量很低。骆驼和羊驼包含一种独特类型的抗体，这类抗体缺乏轻链。因为比常规抗体缺失CH1，这些所谓的重链抗体有较低的分子量。这类免疫球蛋白可变的重链简称VHH，以区别于经典的重链可变区。因此，单个域VHH 是最小可用完整抗原结合15 kDa 片段，被称为纳米抗体。纳米抗体与Fab、Fv或单链抗体相比，有一些独特的优势，如更稳定、更易于在细菌表达。现有技术中抗CD3抗体形式单一并且不能满足实际需求，因此有必要开发出更多的抗CD3抗体，从而为生产和设计功能蛋白提供更多的选择。
技术实现思路
本专利技术一方面涉及一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。本专利技术另一方面涉及一种编码本专利技术的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。在一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在另一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。本专利技术再一个方面涉及一种表达载体，其包含本专利技术的核苷酸序列。本专利技术还涉及包含该表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中，该宿主细胞是大肠杆菌。本专利技术还涉及一种双特异性抗体，其包含本专利技术所述的任一CD3单域抗体。本专利技术提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3ε N-末端部分，这些抗体可以用于比如CD3的测定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如双特异性抗体。附图说明图1是sdAb噬菌体展示库的骨架图。图2显示了血清效价实验结果。图3.淋巴细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物Marker III；第1-3泳道，分离自第一次抽血的淋巴细胞的总RNA；第4-7泳道，分离自第二次抽血的淋巴细胞的总RNA；第8-10泳道，分离自第三次抽血的淋巴细胞的总RNA。图4.纯化的VHH PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物Marker III；第1-8泳道，使用8对引物从第一次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物；第9-16泳道，使用8对引物从第二次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物；第17-24泳道，使用8对引物从第三次抽血的PBMC得到的纯化的VHH PCR产物。图5. sdAb噬菌体展示库的插入率。使用M13R (-48)和M13F (-47)引物通过PCR扩增96个随机选取的文库克隆。具有~1100 bp DNA条带的克隆具有VHH插入物。具体实施方式本专利技术现将结合以下实验及附图进一步阐释，需要说明的是，这些实验例及附图不应解释为对本专利技术的限制。1 策略本专利技术通过噬菌体展示技术开发出了抗CD3的单域抗体，并且进行了以下步骤：动物免疫和免疫响应测试、sdAb噬菌体展示库的构建、噬菌体展示淘选以及FASEBA筛选和FACS验证。2 材料抗原蛋白： CD3-His蛋白(MP-5)抗原细胞系: Jurkat靶标细胞, KPCN对照细胞TRIzol® Reagent (Ambion, Cat. No. : 15596-026)PrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara, Cat. No. : 6110A)Sfi I酶(NEB, Cat. No. : R0123S)宿主菌: E.coli SS320氨苄青霉素, 100 mg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG), 1 MPBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4ELISA微滴定板 (Corning, Cat. No. : 9018)包被缓冲液: 0.05 M NaHCO3, pH 9.6封闭缓冲液 (PBST): PBS缓冲液, pH 7.4,加入5%脱脂奶粉洗涤缓冲液: PBS缓冲液, pH 7.4, ,加入0.05% Tween 20M13KO7辅助噬菌体(NEB, Cat. No. : N0315S)HRP/抗M13单克隆抗体 (GE Healthcare, Cat. No. : 27-9421-01)羊抗驼IgG[HRP] (Novus Biological, Cat. No. : NB7242)兔抗驼IgG[HRP] (GenScript)FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA)Flowjo: Flowjo 7.6.1 Min software2×YT: 16 g胰蛋白胨, 10 g酵母提取物, 5 g NaCl溶解于1 L ddH2O.OctetRED96 (ForteBio)Super Streptavidin (SSA) Dip and ReadTM Biosensors (ForteBio)10 mM 甘氨酸-HCl, pH 2.03方法3.1动物免疫和免疫响应测试3.1.1 动物免疫将CD3-His免疫原与佐剂或PBS混合并注射到美洲驼（llama）。在整个项目过程中，动物被免疫五次。分别在免疫之前以及第4次和第5次免疫之后采集外周血样品。梯度分离法分离出淋巴细胞。细胞中加入RNAlater并储存于-80°C。离心加入了抗凝剂的血液得到血清，并储存于-80°C。3.1.2 免疫响应测试使用血清样品通过ELISA评价针对固定的免疫原的免疫响应。评价了免疫前以及第4次和第5次免疫后的血清。抗原(CD3-His和CD34-Fc)分别稀释于4 μg/ml的包被缓冲液中。使用稀释的抗原对微滴定板包被过夜，4°C。随后，以洗涤缓冲液洗涤微滴定板3次，再于37°C用封闭缓冲液封闭2小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。将一系列稀释的血清加入板上，在37°C孵育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。加入羊抗驼IgG [HRP]或兔抗驼IgG [HRP]，在37°C孵育1小时。洗涤后，反应物中加入TMB底物反应10分钟，随后加入1 M HCl终止反应。MK3分光计测定每孔在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。
【技术特征摘要】
1.一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3。2.一种编码权利要求1所述的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。4.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其中所述核...
【专利技术属性】
技术研发人员：李庆，王忠，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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