一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，包括包被的水产品中甲基睾酮与载体蛋白的偶联物，所述水产品中甲基睾酮的特异性抗体和酶标二抗。本发明专利技术的检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒为多残留检测试剂盒，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；最低检测限达0.31μg/L，可直接判断样品是否超标，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在水产品中甲基睾酮残留检测中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒
本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留监测分析
中的一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
甲基睾酮（Methyltestosterone，MT），是一种人工合成的类固醇激素，具有增强雄性体性特征和促生长等作用。在水产养殖行业中为提高鱼体成活率高和增加产量，常在鱼苗培育过程中通过在鱼饲料或其它投入品掺入一定量的MT，实现鱼体的雄性化，达到单性养殖生产的目的。研究表明，MT在水产动物体内的代谢缓慢，痕量的残留可能会扰乱人体内激素平衡，导致肝中毒或其它重要组织器官发生生理病变，甚至具有潜在致癌作用。因此，欧美等多个国家将其列为水产养殖中的禁用药物，我国农业部在2002年颁布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》将其列为兽药残留的重要检测对象，规定在动物性食品的可食组织中不得检出MT。目前，检测MT主要有高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和免疫分析法(IA)等。其中仪器方法准确、灵敏，但分析时间长，设备相对昂贵，不适于现场快速筛选及检测。而免疫分析法，特别是基于抗原抗体反应的酶联免疫吸附法(ELISA)具有特异性强、灵敏、简便、准确和样品通量高等优点，非常适于现场快速检测，不过现有关于甲基睾酮的ELISA多以血液、尿液或毛发等为检测对象，针对养殖水产品中MT残留量测定的研究甚少。本研究在成功制备甲基睾酮半抗原和特异性抗体基础上，优化确定ELISA各项检测条件，同时结合分散固相萃取技术消除水产样品中的基质干扰。本方法操作简单、快速、灵敏度高，测定结果和液相色谱-质联用法呈现良好的相关性，为快速测定水产品中痕量残留的甲基睾酮提供一种有效的技术手段。专利技术创造内容本专利技术的目的是提供一种检测本专利技术的目的是提供一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，包括包被的水产品中甲基睾酮与载体蛋白的偶联物，所述水产品中甲基睾酮的特异性抗体和酶标二抗。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括A，B，C，D，E，F试剂液、G试剂液、H试剂液、I试剂液、J试剂液、K试剂液。所述A，B，C，D，E，F试剂液为甲基睾酮系列浓度标准溶液。所述G试剂液为HRP标记的羊抗兔IgG抗体，武汉博士德生物工程有限公司。所述H试剂液为抗体稀释度为1/1.2×105。所述I试剂液为四甲基联苯胺。所述J试剂液为PBS缓冲液。所述K试剂液为终止液。所述甲基睾酮的特异性抗体为甲基睾酮单克隆抗体；所述甲基睾酮单克隆抗体为鼠源抗体，所述多西环素单克隆抗体优选为大豆凝集素鼠克隆抗体。以上抗体均可用甲基睾酮与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白为所述载体蛋白可谓牛血清蛋白（BSA）等常用载体蛋白。所述标记酶可谓辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶；所述二抗可为抗兔抗体。可作为固定甲基睾酮与载体蛋白的偶联物的载体的物质很多，如聚苯乙烯等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。在优选的条件下，本专利技术的检测甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，包括包被的与甲基睾酮载体蛋白的偶联物，甲基睾酮的特异性抗体和酶标二抗。本专利技术的检测原理为将甲基睾酮与载体蛋白的偶联物做包被原吸附于固相载体上，加入样品和特异性抗体，再加入酶标二抗，待测样品中残留的甲基睾酮和固相载体上包被的甲基睾酮与载体蛋白的偶联物竞争结合特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中甲基睾酮残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出甲基睾酮的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的甲基睾酮标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。本专利技术主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测水产品中甲基睾酮的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；最低检测限达0.31μg/L，可直接判断样品是否超标，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在水产品中甲基睾酮残留检测中发挥重要作用。附图说明图1甲基睾酮ELISA标准曲线。具体实施方式实施例1、抗原及抗体的制备（1）采用琥珀酸酐法衍生化制备半抗原MT17，进一步偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)制备免疫原MT17-KLH。（2）采用活泼酯法将半抗原MT17与载体蛋白KLH和BSA偶联，反应液置于0.9%NaCl溶液中，4℃下透析72h，分别制备免疫原MT17-KLH和包被原MT17-BSA（图1），偶联物采用紫外扫描光谱进行鉴定。（3）用MT17-KLH（1g/L）免疫新西兰大白兔，每次免疫剂量500μg（按KLH量计算），每隔3周加强免疫一次，第5次免疫9d后心脏取全血，血清经辛酸-硫酸铵法纯化，-20℃保存。实施例2、检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒（1）检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒的结构所述试剂盒还包括A，B，C，D，E，F试剂液、G试剂液、H试剂液、I试剂液、J试剂液、K试剂液。所述A，B，C，D，E，F试剂液为甲基睾酮系列浓度标准溶液。所述G试剂液为HRP标记的羊抗兔IgG抗体，武汉博士德生物工程有限公司。所述H试剂液为抗体稀释度为1/1.2×105。所述I试剂液为四甲基联苯胺。所述J试剂液为PBS缓冲液。所述K试剂液为终止液。实施例3、样品的前处理及检测（1）鱼虾类样品取可食肌肉部分，均质处理成肉糜状的待测试样。称取试样5.0g于50mL聚苯乙烯离心管中，加入20mL乙腈，均质处理1min，加入10.0g无水Na2SO4漩涡混合2min，超声波提取10min，4000r/min离心5min后收集上清液，重复提取一次。净化：上清液减压蒸干，加入2mL50%甲醇-PBS溶液复溶，取1mL复溶液转入装有40mgPSA的离心管中，充分漩涡震荡2min，10000r/min离心5min后吸取上清液测定。（2）检测检测前将试剂盒恢复室温（18℃—30℃），再用A，B，C，D，E，F试剂液为标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，,取包被有甲基睾酮的的微孔包被板，加入50μL的甲基睾酮或处理好的样品到各自的微孔中，加50μL以缓冲液稀释的甲基睾酮抗体，25℃反应0.5小时，用洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的l00μL羊抗兔抗体，25℃反应0.5小时，用洗涤液洗六3次，加底物A、B各50μL，25℃反应15min后每孔加入M终止液（1mol/L硫酸）100μL,用酶标仪测定450nm处A450值。按下式计算百分吸光度值：（B—准溶液或样品的平均吸光度值；B0—为0浓度的标准溶液平均吸光度值）百分吸光度值=B/B0×100%以标准溶液中甲基睾酮浓度的对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，从标准曲线上计算出试样溶液中甲基睾酮的浓度。实施例4、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度（1）试剂盒灵敏度试验向罗非鱼、鲫鱼、甲鱼和对虾四种空白的样品中分别添加1、5和10μg/kg三个水平的MT药物标准液，每个浓度水平做3次平行试验（表1），加标回收率为81.02~103.19%，相对标准偏差（RSD）为4.46%~13.14%。为进一步确定所建立方法的准确度，选取罗非鱼和对虾加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，甲基睾酮标准品，水产品中甲基睾酮的抗体冻干品，甲基睾酮的羊抗鼠抗体，洗涤液所组成。

【技术特征摘要】
1.一种检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，甲基睾酮标准品，水产品中甲基睾酮的抗体冻干品，甲基睾酮的羊抗鼠抗体，洗涤液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测水产品中甲基睾酮的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括，免疫原、包被原和单克隆抗体的制备及样本前处理，其特征在于：（1）采用琥珀酸酐法衍生化制备半抗原MT17，进一步偶联钥孔血蓝蛋白(KLH)制备免疫原MT17-KLH；（2）采用活泼酯法将半抗原MT17与载体蛋白KLH和BSA偶联，反应液置于0.9%NaCl溶液中，4℃下透析72h，分别制备免疫原MT17-KLH和包被原MT17-BSA（图1），偶联物采用紫外扫描光谱进行鉴定；（3）用MT17-KLH（1g/L）免疫新西兰大白兔，每次免疫剂量500μg（按KLH量计算），每隔3周加强免疫一次，第5次免疫9d后心脏取全血，血清经辛酸-硫酸铵法纯化，-20℃保存；（4）将MT标准物用缓冲液配制成系列浓度的标准工作液，优化确定icELISA包被原浓度、抗体稀释度、抗体反应时间和药物稀释液等反应条件；采用OriginPro8.0软件四参数对数函数进行数据分析，绘制竞争标准曲线，其中横坐标为MT标准液浓度的对数值，纵坐标为B/B0（B为添加竞争药物时的吸光值，B0为不添加药物时的吸光值），计算获得icELISA的最低检测限（LOD），抑制浓度（IC50）、线性检测范围等参数，基于上述的最佳检测条件，建立了甲基睾酮icELISA标准曲线（图1），IC50为3.48μg/L，最低检测限为0.31μg/L，定量检测线性范围为0.77~13.06μg/L，满足GB21981-2008和SC/T3029-2006的相关检测要求；特异性分析：选用MT结构类似药物进行icELISA测定，以交叉反应（CR）评价方法的特异性，结果按式计算：CR/%=[IC50（MT）/IC50（其它药物）]x100%。3.（6）样本处理：鱼虾类样品取可食肌肉部分，均质处理成肉糜状的待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，张淑雅，刘静，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32